Antysensowne hamowanie białka zapalnego makrofagów 1- blokuje niszczenie kości w modelu choroby szpiczaka kości ad 6

Poziomy ekspresji A5 były znacznie zmniejszone w komórkach AS-ARH w porównaniu z komórkami WT- lub EV-ARH. Figura 8Adhezja komórek WT-, EV- lub AS-ARH do komórek zrębowych szpiku ST2 myszy i poziomy ekspresji mRNA integryny av ludzkiej. (a) Komórki WT-, EV- lub AS-ARH (106) w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS hodowano wspólnie z komórkami zrębu myszy ST2 (106) w sześciostudzienkowych płytkach. Po 4 dniach płytki intensywnie przemywano pięciokrotnie 3 ml pożywki RPMI-1640 bez surowicy, aby usunąć nieprzylegające komórki ARH. Komórki utrwalono acetonem, a następnie wybarwiono H & E. Zabarwione na niebiesko komórki plazmatyczne przyłączone do komórek ST2 oceniano za pomocą odwróconego mikroskopu, zliczając dziesięć losowych pól (x 400). Liczba komórek AS-ARH przyczepionych do komórek zrębowych ST2 myszy była znacznie zmniejszona w porównaniu z komórkami EV lub WT-ARH. (b) Poziomy ekspresji mRNA dla integryny a1 zmierzono zgodnie z opisem w Metodach. Poziomy ekspresji dla ludzkich mRNA integryn a3, a4, a6, a7 nie były zmienione przez MIP-1 .. Przeciwnie, poziomy ekspresji mRNA dla ludzkich integryn A5 i Ap były znacząco zmniejszone w komórkach AS-ARH i zwiększały się dwa do czterokrotności w komórkach AS-ARH traktowanych MIP-1 .. Leczenie komórek WT- lub EV-ARH anty-MIP-1. Ab zmniejszyło ekspresję mRNA ludzkiej integryn y5 i a1 o około 50% (* P <0,05). Podobne wyniki zaobserwowano w dwóch niezależnych eksperymentach. Figura 9 Ekspresja ludzkiej integryny a5 w komórkach WT-, EV- lub AS-ARH i wpływ anty-CD49e Ab (ludzkiej integryny a5) na przyleganie komórek ARH do komórek zrębowych szpiku ST2 myszy. (a) Analiza Western blot do ekspresji integryny. 5 VLA5 w komórkach WT-, EV- i AS-ARH. Analizę Western blot przeprowadzono zgodnie z opisem w Methods. W komórkach AS-ARH zaobserwowano więcej niż 70% redukcji a5 w porównaniu z komórkami WT lub EV-ARH. Podobny wzór wyników zaobserwowano w dwóch niezależnych eksperymentach. (b) Wpływ Ab na integrynę A5 VLA5 na przyleganie komórek ARH do komórek zrębowych szpiku ST2. Testy adhezji przeprowadzono w sposób opisany w Metodach. Ab do 5, ale nie do AV3, blokowało przyleganie komórek WT- lub EV-ARH do komórek ST2. Podobny wzór wyników zaobserwowano w dwóch niezależnych eksperymentach. * P <0,05. Wyniki badań PCR sugerują, że transfekcja komórek ARH antysensownym do MIP-1. doprowadziło do obniżenia poziomu mRNA (> 5 | 3). Następnie analizowaliśmy ekspresję powierzchniową integryny y2 (CD18), integryny y1 (CD29) i integryny y5 (CD49e) poprzez barwienie immunofluorescencyjne i cytometrię przepływową. Wyniki są przedstawione na Figurze 10. Jak można zobaczyć na Figurze 10, zaobserwowano wyraźne zmniejszenie natężenia fluorescencji (szczytowy kanał średni lub PMC) integryny a1 w AS-ARH w porównaniu z EV-ARH (z 28. 31, do 14 jednostek fluorescencji, odpowiednio) z jednoczesnym zmniejszeniem odsetka komórek dodatnich z 58% do 34%. W przeciwieństwie do integryn | 3, nie zaobserwowano spadku PMC w wybarwieniu powierzchni dla integryn y2 między EV-ARH i AS-ARH. Podobnie, zaobserwowano również spadek wartości a5 w komórkach AS-ARH w porównaniu z komórkami EV-ARH z komórek 58% dodatnich do komórek 22% dodatnich, chociaż całkowite wybarwienie dla <5 było znacznie niższe w porównaniu z A1. Obserwowano równoczesne zmniejszenie PMC z 9,3 do 7,1 pod względem ekspresji a5 przez komórki AS-ARH, zgodnie z obserwowanym spadkiem odsetka komórek dodatnich. Figura 10 Barwienie immunofluorescencyjne dla CD18, CD29 i CD49e. Komórki barwiono i analizowano, jak opisano w Metodach. Barwienie komórek EV-ARH porównano z komórkami AS-ARH dla danego Ab. Dla każdego Ab komórki również barwiono dopasowanym pod względem izotypu Ab dla kontroli w celu wybarwienia tła. Dwadzieścia tysięcy komórek analizowano dla każdej próbki. (a i c) komórki EV-ARH. (b i d) komórek AS-ARH. Te dane sugerują, że zmniejszona ekspresja integryny A5.1 w komórkach AS-ARH była odpowiedzialna za ich zmniejszone przyleganie do komórek zrębowych szpiku. Aby przetestować tę możliwość, komórki WT-, EV- lub AS-ARH hodowano wspólnie z komórkami ST-2 w obecności lub nieobecności blokującego Ab do integryny A5, izotypu kontrolnego Ab lub anty-avp3. . Jak pokazano na Figurze 9b, leczenie współhultur z przeciwciałem anty-A5 znacznie zmniejszyło wiązanie się komórek WT- lub EV-ARH z komórkami zrębowymi szpiku. Anty-vv3 lub AB kontroli izotypowej nie wpłynęły na przywieranie komórek WT lub EV-ARH do komórek ST2. Dyskusja Obecne badanie pokazuje, że blokowanie MIP-1. aktywność w modelu in vivo choroby szpiczaka ludzkiego zmniejsza zarówno zniszczenie kości, jak i obciążenie nowotworem u tych zwierząt. W połączeniu z naszymi poprzednimi danymi, które MIP-1. poziomy są zwiększone u pacjentów z aktywnym szpiczakiem, te dane sugerują, że MIP-1. może być ważnym czynnikiem pośredniczącym w rozwoju szpiczaka i chorób kości [podobne: eve online trial, rezonans magnetyczny kościerzyna, łyżeczka cukru ile to gram ] [podobne: mięśnie grzbietu anatomia, sushi a karmienie piersią, dawstwo komórek jajowych ]