Antysensowne hamowanie białka zapalnego makrofagów 1- blokuje niszczenie kości w modelu choroby szpiczaka kości ad

Komórki ARH (105) w fazie wzrostu wykładniczego wysiewano na pożywkach RPMI-1640 zawierających 10% FBS (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA) w sześcio-studzienkowe płytki przez 24 godziny, a następnie transfekowano MIP-1. konstrukt antysensowny lub pusty wektor przy użyciu Lipofectamine Plus (Life Technologies Inc.) w pożywce bez surowicy, zgodnie z protokołem producenta. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji pożywki usunięto i dodano świeżą pożywkę zawierającą 10% FBS i 500 .g / ml G418. Po 2 tygodniach hodowli z G418, komórki ARH rozcieńczono na 96-studzienkowych płytkach w celu wyizolowania pojedynczych klonów, klonów ekspandowano i poziomów ekspresji MIP-1. zostały określone przy użyciu ludzkiego MIP-1. (hMIP-1 .) zestaw do testu immunologicznego (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Transfekcję komórek ARH za pomocą pcDNA3 Konstrukty reporterowe GAL i test P-galaktozydazy zastosowano do określenia wydajności transfekcji. Linię komórkową ARH z pustymi wektorami wytworzono w sposób opisany powyżej, z tym wyjątkiem, że komórki były trwale transfekowane pustym wektorem pcDNA3. Zbudowaliśmy dwie stałe linie komórkowe zarówno z komórek transfekowanych antysensownym (AS), jak i pustym (EV). Wzorce wzrostu rodzicielskich komórek ARH (WT-ARH) i antysensownego MIP-1. (AS-ARH) lub puste komórki kontrolne wektora (EV-ARH) oznaczono przez hodowlę komórek (104 komórek / studzienkę) przez 7 dni w pożywkach RPMI-1640 zawierających 10% FBS (Life Technologies Inc.) w obecności lub nieobecności linii komórkowej zrębu szpiku ST2 STO (104 komórki / płytkę) na plasterkach zębiny w 48-studzienkowych płytkach. Komórki ST2 hodowane na zębinie zostały wykorzystane jako model mikrośrodowiska kości. Następnie zliczono liczbę komórek w każdym punkcie czasowym. MIP-1. poziomy w kondycjonowanej pożywce pod koniec 3 dni hodowli oznaczano w trzech powtórzeniach hodowli przy użyciu komercyjnego testu ELISA (R & D Systems Inc.). Nie było znaczącej różnicy w charakterystyce wzrostu linii komórkowych WT-ARH, AS-ARH lub EV-ARH. Linia komórkowa AS-ARH, która wytworzyła najniższy poziom MIP-1. w kondycjonowanych pożywkach użyto następnie do badań in vivo. Rysunek Konstrukcja MIP-1. antysensowny. Pierwszy ekson MIP-1. cDNA wytworzono standardowymi technikami PCR, jak opisano w Methods. Tożsamość MIP-1. cDNA zostało potwierdzone przez analizę sekwencji i zostało subklonowane do wektora pcDNA3. Klony, które miały odwrotną orientację dla MIP-1. cDNA przeszukiwano za pomocą PCR, a orientacja została potwierdzona przez analizę sekwencji DNA. Badanie właściwości adhezyjnych i ekspresji mRNA ludzkich integryn y1 w komórkach WT-ARH, EV-ARH lub AS-ARH in vitro. Test adhezji przeprowadzono zgodnie z metodami Kim i in. (7) z niewielkimi modyfikacjami. Komórki ST2 (106) wysiewano na sześcio-studzienkowe płytki w. MEM (Life Technologies Inc.) zawierającym 10% FBS. Po 24 godzinach komórki WT-, EV- i AS-ARH (106) dodano do komórek ST2 i komórki hodowano wspólnie w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS przez 3 dni. Płytki hodowlane następnie intensywnie przemywano pięciokrotnie 3 ml wolnej od surowicy RPMI-1640. Pozostałe komórki utrwalono acetonem, wybarwiono hematoksyliną i wybarwiono kontrastowo eozyną. Komórki plazmatyczne (EV-ARH, AS-ARH lub WT-ARH), które zabarwiono na niebiesko i przyczepiono do komórek ST2, oceniono na 10 losowych mikroskopijnych polach (x 400). Poziomy ekspresji mRNA ludzkiej integryny w komórkach WT-, EV- lub AS-ARH określano za pomocą analizy RT-PCR. Startery PCR i warunki PCR dla ludzkich integryn a | 3, a4, a5, a6, a7 i a pokazano w Tabeli 1. Ludzki specyficzny GAPDH był stosowany jako kontrola wewnętrzna z użyciem starterów GAPDH specyficznych dla człowieka ( 208 bp), 5 -CTC TGA CTT CAA CAG CGA CA-3. (sens) i 5 (3-TCT CTC TCT TCC TCT TGT GC-3. (antysensowny). Wszystkie warunki PCR były w liniowej fazie reakcji. W wybranych eksperymentach do kolonii dodano blokujące Ab (20 mg / ml) do a 5 integryny a5 (3l (P1D6, Life Technologies Inc.). Tabela Sekwencje starterów PCR i warunki dla ludzkich integryn Analiza Western blot integryny A5 w komórkach WT-, EV- i AS-ARH. Poziomy białka ludzkiej integryny A5 testowano za pomocą analizy Western blot. Komórki WT-, EV- i AS-ARH (105) zawieszono w 200 .l buforu do ładowania SDS i poddano analizie PAGE. Żele przeniesiono na błony nitrocelulozowe i błony przepuszczono przez mAb anty-CD49e (a5 integryny) (1: 200) (P1D6, Life Technologies Inc.), a następnie przeciw-mysie IgG skoniugowane z peroksydazą (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i wizualizowane przez chemiluminescencję na filmach rentgenowskich. MAb anty-aktyny (Sigma Chemical Co.) zastosowano jako kontrolę wewnętrzną na tych samych membranach po usunięciu anty-CD49e Ab z 1% SDS. Rozwój choroby szpiczaka i obciążenia nowotworem myszy SCID transplantowanych komórkami AS-ARH lub EV-ARH in vivo
[hasła pokrewne: sushi a karmienie piersią, pierwsza pomoc oparzenia, olej z awokado właściwości ]
[hasła pokrewne: eve online trial, eve online polska, eve poradnik ]