Antysensowne hamowanie białka zapalnego makrofagów 1- blokuje niszczenie kości w modelu choroby szpiczaka kości cd

Trzy miliony komórek WT-ARH, komórek AS-ARH lub komórek EV-ARH wstrzyknięto dożylnie myszom SCID, które otrzymały napromienianie całego ciała w dawce 3,75 Gy 24 godziny przed przeszczepieniem. Wykazaliśmy wcześniej, że ten protokół jest wystarczający do wywołania choroby szpiczaka kości u tych myszy w ciągu 28. 35 dni po transplantacji (1). Zwierzęta następnie obserwowano pod kątem rozwoju choroby szpiczaka, hiperkalcemii i przeżycia, jak opisano wcześniej (1). Gdy zwierzęta rozwinęły paraplegię, zostały poddane eutanazji, a kręgi i kości długie poddano analizie histomorfometrycznej dla powierzchni OCL i osteoblastów, erozji powierzchni, OCL na jednostkę powierzchni i objętości guza, jak opisano wcześniej (8). Pod koniec eksperymentu MIP-1. poziomy mierzono w osoczu szpikowym, a poziomy ludzkiej IgG (hIgG) mierzono w surowicy zwierząt za pomocą dostępnych w handlu testów ELISA (MIP-1 ., R & D Systems Inc.) (hIgG, AlerCHEK Inc., Portland, Maine, USA). Ponadto próbki osocza szpiku od zwierząt badano pod kątem ich zdolności do symulowania tworzenia OCL w hodowlach ludzkich szpiku, jak opisano poniżej. W wybranych doświadczeniach myszy przeszczepiono komórkami AS-ARH lub EV-ARH, jak opisano powyżej i uśmiercano w 3, 6, 9 lub 15 dniu po transplantacji i oceniano pod kątem obecności komórek nowotworowych za pomocą PCR z użyciem starterów GAPDH specyficznych dla człowieka ( patrz wyżej) i histomorfometrią. Startery GAPDH, które wykryły sekwencję konsensusową w mysim i ludzkim GAPDH, zastosowano jako kontrolę wewnętrzną dla całkowitej ekspresji GAPDH (sens 5A-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 (3 antysensowny 5a-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA -3.). Testy tworzenia OCL. Nieprzylegające jednojądrzaste komórki ludzkiego szpiku kostnego otrzymano od zdrowych dawców, jak opisano uprzednio (9) i badano pod kątem ich zdolności do tworzenia wielonukleowanych komórek (MNC) podobnych do OCL w długotrwałych hodowlach szpiku. Badania te zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board w University of Texas Health Science Center w San Antonio. Hodowle potraktowano albo 200 pg / ml rekombinowanego hMIP-1. (R & D Systems Inc.) lub 10% obj./obj. Osocza szpiku od zwierząt przeszczepionych komórkami WT-ARH, komórkami EV-ARH lub komórkami AS-ARH. Osocze szpiku otrzymuje się przepłukując kości udowe 0,5 ml MEM-10% FBS zawierającego 100 U / ml heparyny wolnej od środków konserwujących, peletkuje komórki przez wirowanie przez 10 minut przy 1500 g i zbiera supernatanty. W wybranych eksperymentach hodowle traktowano również neutralizującym Ab do ludzkiego MIP-1. (5 ng / ml) (R & D Systems Inc.), który jest wystarczający do zneutralizowania do 500 pg / ml MIP-1 .. Pod koniec 3 tygodni hodowli określono liczbę MNC, które przereagowały krzyżowo z mAb 23c6. MAb 23c6 identyfikuje komórki podobne do OCL, które wyrażają receptory kalcytoniny i resorb kości (3). Aktywowana fluorescencją analiza sorterów komórkowych komórek ARH pod kątem ekspresji integryny CD29 (a1), integryny CD49e (a5) i CD18 (integryna y2). Analizy przeprowadzono jak opisano wcześniej (10). Pokrótce, przygotowano probówki zawierające 106 komórek AS-ARH lub EV-ARH i dodano 20 ul Ab do 100 ul zawiesiny komórek (107 komórek / ml). Komórki inkubowano przez 30 minut w 4 ° C. Po przemyciu w celu usunięcia niezwiązanego Ab, procent komórek eksprymujących różne integryny określono za pomocą cytometrii przepływowej (FACScalibur; Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA). Zebrano dwadzieścia tysięcy wydarzeń. Analizę wyników przeprowadzono za pomocą programu Cell-Quest (systemy immunocytometryczne Becton Dickinson), a procent uzyskanych komórek dodatnich skorygowano pod względem barwienia tła, odejmując wartość uzyskaną z kontroli izotypu Ab. Integryna anty-A.1 (4B4, CD29-FITC), anty-A5 (CD49e-FITC) i integryna anty-A 2 (CD18-FITC) pochodziły z Immunotech (Immunotech, Marsylia, Francja). Ab. I kontrole dopasowane do izotypu pochodziły od tej samej firmy. Analiza statystyczna. Wyniki in vitro i in vivo przedstawiono jako średnią plus lub minus SEM dla pięciu powtórzeń próbek i porównano je za pomocą testu t Studenta. Wyniki uznano za znacząco różne dla wartości P mniejszych niż 0,05. Wyniki Jak pokazano na Figurze 2a, nie było znaczącej różnicy w charakterystyce wzrostu komórek WT-ARH, EV-ARH lub AS-ARH. Ponadto, hodowla komórek WT-ARH, AS-ARH lub EV-ARH z komórkami ST2, linia komórek zrębowych mysiego szpiku, na odcinkach zębiny wykazywała podobną charakterystykę wzrostu (Figura 2b). Jednak MIP-1. poziomy w pożywce kondycjonowanej przez 3 dni przez komórki były znacząco różne (Figura 2c). Komórki AS-ARH wytwarzały około 30. 50 pg / ml MIP-1. w 3-dniowej kondycjonowanej pożywce, w przeciwieństwie do 1000. 1200 pg / ml MIP-1. dla linii komórkowej WT-ARH lub komórek EV-ARH. Figura 2 Charakterystyka wzrostu komórek WT-, EV- i AS-ARH in vitro
[podobne: szpital psychiatryczny lublin, eve poradnik, olej z awokado właściwości ]
[przypisy: eve online pl, łyżeczka cukru ile to gram, sanatorium krynica górska ]