Cystin, nowe białko związane z rzęskami, zostaje rozbity w mysim modelu cpk w postaci policystycznej choroby nerek ad 5

Podobnie, nieco większy transkrypt 2,4 kb był wyrażany głównie w nerce płodowej człowieka. Wzór ekspresji transkryptu cpk i charakterystyka przewidywanego produktu białkowego. (a) Rozkład tkanek transkryptu cpk o 2,2 kb pokazano w dojrzałych tkankach myszy. Wielkość poliadenylowanego transkryptu jest zgodna z cDNA o pełnej długości 1,856 bp. Znaczniki rozmiaru są wskazane po lewej stronie i wyrażone jako kilobazy. (b) Analiza Northern błot mysiego płodowego poli (A +) RNA ujawniła transkrypt o 2,2 kb w nerce płodowej. (c) Analiza metodą northern blot ludzkiego płodowego poli (A +) RNA wykazała transkrypcję 2,4 kb w nerce płodowej. (d) Względną ekspresję transkryptu cpk o 2,2 kb pokazano w RNA poli (A +) nerki i wątroby z 2-tygodniowego B6-WT (n = 5 myszy) i B6-cpk / cpk (n = 5 myszy ) (Górny panel). Rehybrydyzacja z cDNA Gapdha służyła jako kontrola obciążenia (środkowy panel). RT-PCR przeprowadzono przy użyciu par primerów flankujących delecję na tym samym poli (A +) RNA (dolny panel). (e) Sekwencja aminokwasowa przewidywanego produktu białkowego 145-AA. Przewidywane są dwa potencjalne miejsca mirystoilacji (reszty 2. 7, 43. 48, oznaczone gwiazdkami), z których pierwsza jest sprzężona z domeną wielozasadową (podkreślona). Transkrypt cpk o 2,2 kb wykryto w nerkach i wątrobie zarówno u 2-tygodniowych myszy B6-WT, jak i B6-cpk / cpk, ale intensywności pasm były względnie zmniejszone w tkankach od zmutowanych myszy (Figura 3d). Dane te wskazują, że transkrypty cpk typu dzikiego i zmutowane są bardziej obficie wyrażane w nerkach niż w wątrobie, a mutacja skracająca zmniejsza ekspresję transkryptu w obu tkankach. Kontrola obciążenia i analiza RT-PCR potwierdziły specyficzność tych wyników Northern blot i wykazały obecność niewielkich ilości transkryptu cpk w zmutowanej wątrobie (Figura 3d). Charakterystyka produktu białkowego. Gen cpk koduje nowe, hydrofilowe białko o 145 aminokwasach, które nazwaliśmy cystyną (rysunek 3e). Wtórne przewidywania strukturalne nie pozwoliły na zidentyfikowanie znaczących struktur alfa helikalnych lub beta w białku. W wyszukiwaniu Motif zidentyfikowano dwa potencjalne miejsca mirystoilacji (aminokwasy [AA] 2. 7 i AA 43. 48), z których pierwszy jest sprzężony z domeną wielozasadową (AA 12-16). Potencjalny szkodnik. polipeptyd wzbogacony w prolinę (P), kwas glutaminowy (E), serynę (S) i treoninę (T). sekwencja jest przewidywana w pozycji 101. 118 (wynik PEST = 6,98). Nie ma dowodów na specyficzne motywy wiążące DNA, ale białko jest bogate w prolinę (10%) i przewiduje się, że ma co najmniej dwa potencjalne sygnały lokalizacji jądrowej (PRRRRSP w AA12. 18 i PEKKVKG w AA 96. 104). Analizy Southern wskazują, że homologi cpk istnieją jako geny pojedynczych kopii u ssaków, w tym ludzi, małp, szczurów, psów i krów, a także u kurcząt (dane nie przedstawione). Jednakże nie wykryto znaczącej homologii z poprzednio scharakteryzowanymi białkami lub domenami białek w poszukiwaniu ludzkich, Caenorhabditis elegans, Drosophila lub baz danych drożdży. Warto zauważyć, że przedział genomowy flankowany przez TIEG2 i RRM2, który obejmuje ludzki ortolog cpk, nie jest zawarty w sekwencji szkicu dostępnej obecnie w International Human Genome Sequence Consortium (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ seq / HsBlast.html). Analiza północna w ludzkich tkankach płodu zidentyfikowała transkrypt 2,4-kb w nerce, ale nie w wątrobie, mózgu ani płucu (Figura 3c). Ludzki pochodzący z biblioteki płodowej EST, AA446394, ma 85% identyczności z cpk ponad 88 nukleotydów i 71% identyczności aminokwasów z karboksylowym końcem białka cystyny (dane nie pokazane). Jednak pełnej długości ludzki ortolog cpk nie został jeszcze zidentyfikowany. Badania transfekcji i lokalizacja subkomórkowa. Pozakomórkową lokalizację białka cystynowego analizowano w komórkach mCCD transfekowanych konstruktem ekspresyjnym zawierającym kompletny region kodujący cystynę klonowany w ramce z karboksylowymi znacznikami c-myc (myc) i histydyną (jego), pod kontrolą EF-1. promotor. Stabilne hodowle komórkowe ustalono przez selekcję w bla- sticydynie. Komórki następnie hodowano na wkładkach do hodowli komórkowych przez co najmniej 3 dni po konfluencji, aby umożliwić rozwój cilii. Te spolaryzowane komórki nie są klonalną linią komórkową, ale raczej reprezentują hodowaną populację komórek, które poddano transfekcji transgenem cystynowym. Ponieważ skuteczność transfekcji w takich eksperymentach jest zwykle mniejsza niż 100%, niektóre komórki w tej populacji nie eksprymowały transgenu. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że białko cystynowe znakowane epitopem zlokalizowane jest w małej domenie na powierzchni wierzchołkowej komórki (Figura 4, bd)
[patrz też: polskie produkty spożywcze, olej z awokado właściwości, dawstwo komórek jajowych ]
[patrz też: łyżeczka cukru ile to gram, sanatorium krynica górska, szpital psychiatryczny lublin ]