Cystin, nowe białko związane z rzęskami, zostaje rozbity w mysim modelu cpk w postaci policystycznej choroby nerek ad 6

W widoku pola szerokiego cystyna była umiejscowiona w środku tej domeny szczytowej w porównaniu z barwieniem ciasnego połączenia przez a-ZO-1 (38) (Figura 4e). Rozkład cystyny pokrywa się z a-tubuliną IV, znanym składnikiem pojedynczej korony wierzchołkowej (39) (danych nie pokazano), jak również polaris (Figura 4, f i g), białka, które jest kodowane przez gen Tg737. i związane z ruchliwymi i nieruchomymi rzęskami (34). Jednakże, w przeciwieństwie do polaryzatu, który jest wyrażany głównie w rzęskowych ciałach podstawowych, a także w aksonem, wydawało się, że ekspresja cystyny jest wzbogacona w aksonowe rzęski, z niewielkim wybarwianiem w podstawowych ciałach (Figura 4g). Obrazy immunofluorescencji są reprezentatywne dla n = 5 eksperymentów. Figura 4Lokalizacja egzogennie eksprymowanej cystyny w stabilnie transfekowanych komórkach mCCD. W celu analizy lokalizacji cystyn, komórki mCCD typu dzikiego transfekowano konstruktem myc i jego epitopem znakowanym cystiną. Stabilne hodowle komórkowe ustalono przez selekcję w bla- sticydynie. Analizę immunofluorescencyjną przeprowadzono w komórkach hodowanych w insertach do hodowli komórkowych przez co najmniej 3 dni po konfluencji, aby umożliwić rozwój cilii. (a) Schemat ideowy głównej komórki z jej pierwotną wierzchołkową cilią. Wskazano dwie płaszczyzny ogniskowe stosowane w obrazowaniu immunofluorescencyjnym. Miejscową płaszczyznę ogniskową zastosowano do wychwytywania cilium i pozycji ciasnego połączenia, wskazanego przez barwienie a-ZO-1, a jądrowa płaszczyzna ogniskowa zidentyfikowała jądra wybarwione HOECHST (niebieskie). (b) Immunofluorescencyjną lokalizację cystyny (zielonej), jak określono za pomocą poliklonalnego Ab anty-jego królika. (c) lokalizacja cystynowa (czerwona) w tych samych komórkach mCCD, jak pokazano w b, po sondowaniu mAb anty-myc. (re). Scalony obraz b i c wykazał kolokalizację (żółtą) myc i jego epitopu znakowanego cystiną. (e) W szerokim polu widzenia, wybarwienie anty-jego poliklonalnym Ab (zielonym) wskazuje, że cystyna umiejscowiona jest w centrum komórek mCCD w stosunku do wąskich połączeń wybarwionych dla ZO-1 (czerwony). (f i g) Szerokie i reprezentatywne poglądy o dużym powiększeniu wykazały kolokalizację egzogennie eksprymowanej cystyny (czerwone, anty-mys mAb) i endogennego polaris (zielony, królicze poliklonalne Ab) w rzęskach komórek mCCD. Dyskusja Zidentyfikowaliśmy przez klonowanie pozycyjne nowego genu zmutowanego w modelu myszy CPC. Analizy Southern wskazują, że gen cpk istnieje jako pojedyncza kopia u myszy i innych ssaków. Gen myszy koduje nowe, hydrofilowe białko o 145 aminokwasach, które nie ma znaczącego podobieństwa do wcześniej scharakteryzowanych białek lub domen białkowych. Jednak w białku obecnych jest kilka przypuszczalnych motywów funkcjonalnych, w tym dwa potencjalne miejsca mirystoilacji, z których więcej N jest sprzężone z domeną wielozasadową. Niedawne badania in vitro wykazały, że N-końcowy mirystoilacja działa jako wewnątrzkomórkowy sygnał asocjacyjny z błoną. Jednak stabilne zakotwiczenie N-mirystoilowanych białek do membran wymaga między innymi powiązania z drugim sygnałem, takim jak szereg dodatnio naładowanych reszt sąsiadujących lub odległych od miejsca lipidowania białka (40). Ten połączony motyw N-mirystoilacji / wielozasadowy reszty jest wykorzystywany przez białka, takie jak c-SRC, c-Ki-ras i mirystolowane białka C-kinazy z kinazą C (MARCKS) w celu zakotwiczenia w błonie (41. 43), co prowadzi nas do spekulować, że cystyna byłaby związana z błoną plazmatyczną i / lub membranami organelli wewnątrzkomórkowych. Zbadaliśmy zatem subkomórkową lokalizację cystyny egzogennie eksprymowanej w komórkach mCCD. W spolaryzowanych komórkach mCCD trwale transfekowanych cystiną typu dzikiego, białko znakowane epitopem zlokalizowane w pojedynczych wierzchołkowych rzęskach za pomocą a-tubuliny IV i polaris. Ale w przeciwieństwie do polaryzmu, który jest wyrażany zarówno w rzęskich ciałach podstawnych, jak iw aksonach, wydawało się, że ekspresja cystyny jest wzbogacona w aksonalny znak żółciowy. Ta subtelna różnica w rozkładzie białek może wskazywać, że cystyna nie uczestniczy w szlaku rzęsek, jak polaris, ale odgrywa nową rolę w funkcji rzęsek. Postawimy hipotezę, że cystina jest związana z błoną aksonów i funkcjonuje jako część szkieletu molekularnego, który stabilizuje zespół mikrotubuli w obrębie aksonów rzęskowych. Na poparcie tej spekulacji zauważamy, że Woo i in. wykazali znaczące osłabienie progresji choroby torbielowatej nerek u myszy cpk / cpk leczonych paklitakselem (Taxolem) i pokrewnymi taksanami, które promują tworzenie mikrotubuli (44). Dla porównania, leczenie paklitakselem było nieskuteczne w homozygotach Tg737orpk (45), zgodnie z modelem, w którym polaris i cystyna odgrywają odrębne, być może kolejne, role w tworzeniu rzęsek i funkcji
[hasła pokrewne: rezonans magnetyczny kościerzyna, przelicznik gram na szklanki, łyżeczka cukru ile to gram ]
[przypisy: pierwsza pomoc oparzenia, rezonans magnetyczny kościerzyna, olej z awokado właściwości ]