Cystin, nowe białko związane z rzęskami, zostaje rozbity w mysim modelu cpk w postaci policystycznej choroby nerek ad

DNA z mysiego klonu BAC, 221A10, z biblioteki BAC myszy RPCI-22 (Research Genetics, Huntsville, Alabama, USA) rozpylono i frakcjonowano pod względem wielkości na 0,8% żelu agarozowym. Fragmenty o wielkości 2. 3 kb i wielkości 3. 4 kb, subklonowane do pUC18, poddano sekwencjonowaniu shotgun, uzyskując trzykrotne pokrycie klonu BAC. Bibliotekę Przygotowanie DNA i sekwencjonowanie w sekwenserze ABI377 przeprowadzono za pomocą Australian Genome Research Facility (Brisbane, Australia). Zgromadzenie i analizę danych sekwencji genomowej przeprowadzono za pomocą oprogramowania PHRED, PHRAP i GAP4 (28-30). Ostateczna sekwencja została zanalizowana przy użyciu podstawowego narzędzia do lokalnego wyrównywania (BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST); REPEATMASKER (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker); GENSCAN (http://CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html); i GrailPRO (http://www.genomix.com/grailpro.htm). Charakterystyka cDNA i analiza sekwencji. Całkowity RNA ekstrahowano z nerek i wątrób 2-tygodniowych myszy typu dzikiego B6 (B6-WT) i B6-cpk / cpk, jak również z mózgu płodu, płuc, wątroby i nerek myszy B6 w dniu embrionalnym 15 (E15) przy użyciu systemu RNA-RNA Total RNA Isolation (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Poli (A) + RNA przygotowano przy użyciu zestawu Oligotex mRNA Midi (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Przewidywaną sekwencję cPNA cpk zmontowano stosując sekwencje w UniGenes Mm.34424 i Mm.52265 jako rusztowanie. Pierwotne i zagnieżdżone reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu następujących starterów (zorientowanych od 5. Do 3. W cDNA): C-1F: 5. -CATCTCCGGCTCTCCTTTTCTGT-3 .; C-1R: 5a-AGAGTAAGCGGGATGAAGAGAGG-3 .; C-2F: 5a – AGATGATTCTTTCGCCCTGACTTC-3 .; C-2R: 5a-AGGGG-GATTCTGGAGGAGTGAG-3 .; C-3F: 5a -TCCTCCCTCCCTATCTCTCCAT-3; C-3R: 5a-ATCCAGCAGGCGTAGGG-TCTC-3; C-4F: 5a-AGACCCTACGCCTGCTGGATCA-3; C-4R: 5a-TTGTCCAGCTCAGCGGCAGTA-3; C-5F: 5a-AACAGCCCCAAGAGACCCGAG-3 .; i C-5R: 5a-GTTGCTAGCTCTGGGAGGTTTT-3 .. Aby uzyskać 5. Na końcu sekwencji cDNA zamplifikowano cDNA z nerki myszy o 5. szybka amplifikacja końców cDNA . PCR (RACE-PCR) z użyciem zestawu do amplifikacji cDNA Marathon (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Kalifornia, USA). Porównywano nukleotydowe sekwencje cDNA cpk ze znanymi genami i wyrażonymi znacznikami sekwencji (EST) wymienionymi w niereduzyjnej kompilacji baz danych GenBank i European Molecular Biology Laboratory, przy użyciu przeszukiwań BLAST (31). Przeprowadziliśmy również porównania aminokwasów z nieredundantnymi bazami Swiss-Prot przy użyciu programu BLASTP. Homologie i motywy domeny białkowej analizowano za pomocą pakietu PredictProtein (http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/). RT-PCR i analiza Northern blot. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono w 40 .l objętości reakcji z 10 .g całkowitego RNA nerki, stosując zestaw Gibco-BRL Superscript RNAse H-Reverse Transcriptase (Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, USA). Podwielokrotności 100 ng cDNA zamplifikowano w reakcjach PCR przy użyciu różnych kombinacji starterów cDNA w standardowych warunkach PCR (30 cykli w 96 ° C przez 30 sekund, 54. 64 ° C przez 30 sekund, 72 ° C przez 30 sekund). Northern blot wytworzono albo z 3 .g RNA poli (A +) nerki i wątroby zebranego z myszy B6-WT i B6-cpk / cpk (n = 5) lub 3 .g poli (A +) mózgu, płuc, wątroby i nerki (A +). ) RNA zebrane z myszy E15 (n = 12) sondowano sondą o sile 351 bp, która obejmuje delecję tandemu (primery C-3F i C-3R). Sondę tę hybrydyzowano również z mysią tkanką wielotorową Northern blot (7762-1, CLONTECH Laboratories Inc.) oraz ludzką płodową Northern blot (7756-1, CLONTECH Laboratories Inc.). Aby ocenić różnicowanie obciążenia RNA, przebadaliśmy pod kątem ekspresji genów utrzymywania czystości przy użyciu starterów specyficznych dla Gapdh: naprzód 5a-TGGAGCCAAACGGGTCATCATCT-3. i odwrotną 5 -GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGAA-3 .. Analiza Southern blot. Używając starterów C-3F i C-4R, wygenerowaliśmy sondę o sile 500 bp z noworodkowego cDNA nerki, która zawierała kompletną otwartą formę odczytu (ORF). Sondę tę hybrydyzowano z trawionym EcoRI genomowym DNA z wielu gatunków (Zoo-blot, 7753-1, CLONTECH Laboratories Inc.), jak również z panelem genomowych DNA B6-WT i B6-cpk / cpk trawionych EcoRI. Bloty przemyto kolejno 2 x SSC 0,1% SDS w RT, 0,5 x SSC 0,1% SDS w 65 ° C i 0,2 x SSC 0,1% SDS w 65 ° C. Budowa transgenów i transfekcja kultur komórkowych. Fragment PCR (BamHI-EcoRI) zawierający sekwencję konsensusową Kozak i kompletną domniemaną ORF amplifikowano z cDNA nerki typu dzikiego i subklonowano do wektora pEF6 / Myc-His A (Invitrogen Corp., San Diego, California, USA) . Konstrukt został zweryfikowany przez analizę sekwencji. Testy transfekcji w celu ekspresji i lokalizacji cystyny przeprowadzono w korowej linii komórkowej zbierającej przewód (mCCD) wyizolowanej z nerki myszy transgenicznej dla wczesnego regionu dużego antygenu T SV40 (32).
[podobne: dom zdrojowy szczawno, eve online spolszczenie, plazminogen polska ]
[hasła pokrewne: plazminogen, dom zdrojowy szczawno, eve online spolszczenie ]