Cystin, nowe białko związane z rzęskami, zostaje rozbity w mysim modelu cpk w postaci policystycznej choroby nerek cd

Transfekcję komórek mCCD cystnowym konstruktem ekspresyjnym cystin typu dzikiego przeprowadzono jak opisano wcześniej przy użyciu Lipofectamine Plus (Life Technologies Inc.). Stabilne linie komórkowe zostały ustalone na drodze selekcji leków za pomocą 15 .g ml-1 blastrudyny. Badania immunoenzymatyczne. Komórki mCCD transfekowane konstruktem cystynowym typu dzikiego hodowano w zbuforowanym zbuforowanym roztworze soli Earle a (Cellgro; Mediatech Inc., Herndon, Virginia, USA) z DMEM-F12 uzupełnionym 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, Utah, USA). USA), 100 j./ml penicyliny, 100 mg / ml streptomycyny, w 5% CO2 / 95% powietrza w 37 ° C. W celu przeprowadzenia badań ekspresji komórki wysiewano w bliskiej konfluencji na 6-mm wkładce do hodowli tkankowych Falcon (3104; Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA). Badania immunoonkalizacji przeprowadzono na konfluentnych hodowlach hodowanych przez co najmniej 3 dni w celu ustalenia pełnej polaryzacji nabłonka. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, 0,2% Triton w PBS przez 10 minut, inkubowano w buforze blokującym (1% BSA w PBS), a następnie 60-minutową inkubację z pierwotnymi Abs rozcieńczonymi w buforze blokującym. Pierwszorzędowe Ab stosowane w tym badaniu to P-mysie mAb mysie (R950-25 rozcieńczone 1: 250, Invitrogen Corp.), a-his-15 królicze poliklonalne Ab (SC-803, rozcieńczone 1: 250; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), mysie a-beta-tubuliny (Mu178-UC rozcieńczone 1: 200, BioGenex Laboratories, San Ramon, Kalifornia, USA), mAb szczurzego a-ZO-1 (rozcieńczone 1: 2, dar DF Balkovetza, University of Alabama w Birmingham), i poliklonalnego Ab królika poliklonalnego (34) (GN593 rozcieńczony 1: 200). Po przemyciu PBS komórki inkubowano przez godzinę ze skoniugowanym z fluorochromem drugorzędowym Ab. Rozcieńczonym 1: 200 w buforze blokującym. Drugorzędowe Abpy były kozimi anty-mysimi IgG (O-6380, Oregon green, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), osiołowe anty-królicze IgG (izotiocyjanian tetrametylo-rodaminy [TRITC], 711-025-152; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) i osła anty-szczurzy IgG (TRITC, 712-295-153; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Jądra barwiono przez 5 minut przy użyciu HOECHST 33528 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) rozcieńczonego 1: 1000 w PBS. Kompletna sekwencja cDNA BAC 221A10 i cPK cpk o wielkości 1,86 kb została przekazana do GenBank (numery dostępu AF390547 dla BAC 221A10 i AF390548 dla mRNA 1856 bp). Wyniki Udoskonalenie okresu kandydata na cpk i wygenerowanie mapy transkryptów. Skonstruowaliśmy zintegrowaną mapę genetyczną i fizyczną regionu 650 kb zawierającego locus cpk (27). Mapowanie rekombinacyjne (dane niepokazane) pozwoliło nam udoskonalić locus cpk do przedziału około 100 kb, wyśrodkowanego na D12Mit12 i ograniczonego przez markery 221A10-SP6 i Rrm2 (Figura 1a). Ten przedział jest zawarty w pojedynczym klonie BAC, 221A10 (Figura 1b). Ryc. Zintegrowana mapa genetyczna i fizyczna okresu kandydata w cpk. Analizy rekombinacyjne udoskonaliły locale cpk do przedziału około 100 kb, wyśrodkowane na D12Mit12 i ograniczone przez 221A10SP6 i Rrm2 (zaznaczone pogrubioną kursywą; a). Dane te umiejscowiły CPP na jednym BAC, 221A10, na naszej mapie fizycznej drożdży i bakterii opartej na sztucznych chromosomach (YAC / BAC) (b). Analizy obliczeniowe zidentyfikowały sześć przypuszczalnych jednostek transkrypcyjnych w obrębie przedziału CPC, a każdy przewidywany gen odpowiadał, przynajmniej częściowo, mysiemu klastrze UniGene (c). Analizy obliczeniowe sekwencji BAC, uzyskane przy użyciu losowej strzelby, zidentyfikowały sześć przypuszczalnych jednostek transkrypcyjnych, które odpowiadały siedmiu mysim klastrom UniGene (Figura 1c). Wcześniej wykluczaliśmy mysie Rrm2 jako gen kandydata cpk (27). Porównawcza analiza sekwencji nie wykazała żadnych zmian par zasad w mysich ortologach LBP-32 i TIEG2 amplifikowanych z cDNA nerki typu dzikiego i cpk / cpk (dane nie pokazane). RT-PCR wskazał, że mRNA odpowiadające UniGene Mm.37574 nie ulegały ekspresji w nerce lub wątrobie. Podczas gdy podobne analizy z Mm.42573 wykazały ekspresję w nerkach i wątrobie, nie wykryto transkryptów metodą Northern blotting. Dlatego też nie przeprowadzono dalszych analiz dla żadnego z klastra UniGene. Identyfikacja transkryptu cpk i charakterystyka sekwencji genomowej. Używając RT-PCR, 5. RACE-PCR biblioteki cDNA przyłączonej do liganda myszy i bezpośrednią analizę sekwencji, ustaliliśmy, że klastry UniGene, Mm.34424 i Mm.52265, reprezentują 5. i 3. kończy się, odpowiednio, jednego transkryptu. Skompilowaliśmy cDNA o pełnej długości 1,856 bp, jak również wariant splicingu 1,786 bp, w którym usunięto 70 nukleotydów odpowiadających resztom 1422. 1492.
[patrz też: eve online polska, pierwsza pomoc oparzenia, ostrzykiwanie osoczem cena ]
[przypisy: eve pl, eve online poradnik, eve online trial ]