Cystin, nowe białko związane z rzęskami, zostaje rozbity w mysim modelu cpk w postaci policystycznej choroby nerek czesc 4

Kodon ATG znajdujący się 905 nt poniżej pierwszego nukleotydu mieści się w sekwencji konsensusowej Kozaka (35), a następnie przewidywana ORF 435 bp i albo 513-bp albo 443-bp3. UTR zawierający nietypowy sygnał poliadenylacji (ATTAAA) 22 nt powyżej ogona poli (A +). CpNA cpk o wielkości 856 bp ma 99% homologię nukleotydów poprzez ORF i 3. UTR z niedawno zgłoszonym cDNA, AK013490, z pełnej biblioteki wzbogaconej RIKEN. Wyrównanie sekwencji cDNA cPNA kandydata i genomowego DNA BAC wykazało, że gen jest kodowany w pięciu eksonach obejmujących 14,4 kb genomowego DNA (Figura 2a). Granice egzon-intron dla tych pięciu eksonów (Tabela 1) odpowiadają sekwencjom konsensusu dla 5. i 3. miejsca łączenia (36). Analiza sekwencji genomowej 3000 pz powyżej kodonu ATG, przy użyciu programów TSSG i TSSW, nie zidentyfikowała silnego miejsca startu transkrypcji. Exon zawiera miejsce startu ATG i ma 100% homologii ze wszystkimi 18 EST zawartymi w UniGene Mm.34424, jak również 15 z 38 EST, które należą do Mm.52265. ORF rozciąga się na ekson 3, podczas gdy eksony 4 i 5 są najwyraźniej nieprzetłumaczone. Przypuszczalne kryptyczne miejsce splicingowe w eksonie 5 odpowiadałoby wariantom splicingu o długości 1,856 pz i 1,786 pz. Rysunek 2. Organizacja sekwencji genowej cpk i identyfikacja mutacji cpk. (a) Wyrównanie cDNA cpk, sekwencji konsensusowych UniGene i sekwencji genomowej BAC wykazało, że gen cpk jest kodowany w pięciu eksonach obejmujących 14,4 kb genomowego DNA. Pierwszy nukleotyd cDNA odpowiada pierwszemu nukleotydowi eksonu 1, który obejmuje 184 bp i jest największym z pięciu eksonów. Ten ekson zawiera miejsce startu ATG, które znajduje się w sekwencji konsensusowej Kozaka (CGCGCCatgG). ORF 435 pz rozszerza się do eksonu 3. Egzony 4 i 5 są najwyraźniej nieprzetłumaczone, a przypuszczalne kryptyczne miejsce składania (gaacagCTG) w eksonie 5 wydaje się odpowiadać za warianty splicingowe o długości 856 pz i 786 pz (szarej ramce). Nietypowy sygnał poliadenylacji (ATTAAA) leży 22-nt powyżej ogona poli (A +). Warto zauważyć, że marker mikrosatelity, D12Mit12, leży w intronie genu cpk. (b) amplifikacja PCR i bezpośrednia analiza sekwencji zidentyfikowały delecje tandemowe 12-bp i 19-bp w eksonie genu cpk. Sekwencja porównawcza jest zaznaczona pogrubioną czcionką. Wynikowe przesunięcie ramki obcina przewidywane białko. Pozycję starterów PCR identyfikuje się strzałkami. Przypuszczalna sekwencja Kozaka jest podkreślona i wyróżniona kursywą. (c) Startery flankujące delecję tandemową w allelu cpk mutantem amplifikują 351-bp produkt z DNA typu dzikiego (B6 i D2), produkt o 320 bp z DNA B6-cpk / cpk i oba prążki z B6- + / heterozygoty cpk i F1 + / cpk. W kluczowych rekombinantach F2cpk / cpk (R1aR5) amplifikowano tylko zmutowany allel 320 bp. Tabela 1cpk Granice intron-egzon Analiza mutacji. Porównawcza analiza sekwencji cDNA kandydata cpk nerki powielonej z każdej z ośmiu, 2-tygodniowych myszy B6-WT i B6-cpk / cpk ujawniła tandemową delecję 12 pz (992delTCGGAGGGCGGC) i 19 pz (1017delGCCGCGGGGCAGGAGGAGA) w zmutowanym cDNA powodując przesunięcie ramki w eksonie 1, które obcina białko (Figura 2b). Występowanie tej delecji tandemowej na tle B6 dostarcza mocnych dowodów, że ten kandydat cDNA jest rzeczywiście związany z fenotypem CPK. Zestaw starterów eksonów zamplifikował 351-bp produkt z genomowego DNA B6-WT, podczas gdy produkt o 320 pz został zamplifikowany z genomowego DNA B6-cpk / cpk (figura 2c). Oba produkty amplifikowano z DNA heterozygot B6 – + / cpk i D2 × B6 – + / cpk F1, ale tylko zmutowany allel 320-bp amplifikowano ze wszystkich pięciu kluczowych rekombinantów F2cpk / cpk. Musimy jeszcze zdefiniować mechanizmy molekularne prowadzące do tej złożonej mutacji. Podczas gdy sekwencja flankująca delecję tandemową jest bardzo bogata w GC, obszerna analiza genomowa nie ujawniła sekwencji homologicznych w punktach przerwania. W związku z tym spekulujemy, że zgodnie z propozycją dla złożonych rearanżacji genomowych opisanych w zmutowanym allelu myszy (37), zdarzenie mutacji w tym genie dotyczyło niehomologicznego mechanizmu rekombinacji. Ekspresja transkryptu cpk i charakterystyka produktu białkowego. Fenotyp cpk obejmuje przede wszystkim torbiele nerek i dysgenezę dróg żółciowych. U dorosłych myszy wykryto transkrypt o 2,2 kb silnie eksprymowany w nerce (Figura 3a). Podobny transkrypt o 2,2 kb wykryto również w wątrobie, z mniejszą ekspresją widoczną w płucach, mózgu i sercu. Przeanalizowaliśmy również ekspresję cpk w tkankach myszy i ludzkich płodów. Analiza Northern blot wykazała, że transkrypt o 2,2 kb był silnie eksprymowany w mysiej nerce płodowej, ale ledwo zauważalny w mózgu płodu, płucach i wątrobie (Figura 3b)
[przypisy: inteligencja interpersonalna, szpital psychiatryczny lublin, mięśnie grzbietu anatomia ]
[podobne: eve online polska, eve poradnik, eve online pl ]