Hiperhomocysteinemia wzmaga stan zapalny naczyń i przyspiesza miażdżycę tętnic w modelu mysim czesc 4

Aby przetestować te koncepcje in vivo, przygotowaliśmy wyciągi jądrowe z aorty i nerek myszy otrzymujących dietę B lub A. W porównaniu z myszami karmionymi dietą A, zwierzęta karmione karmą wzbogaconą w metioninę (dieta B) wykazywały około dziesięciokrotny wzrost translokacji jądrowej NF – AB mierzony za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) przeprowadzonego na ekstraktach jądrowych pochodzących z aorty (Figura 2b, ścieżki 4 i 5, odpowiednio) i około 4,5-krotny wzrost aktywacji NF-kB w ekstraktach jądrowych przygotowany z nerki (rycina 2b, ścieżki i 2, odpowiednio). Figura 2HHcy wzmaga aktywację NF-kB, jak widać z użyciem EMSA. (a) HUVEC eksponowano na BSA, L-HC lub L-cysteinę (100 .M) przez 8 godzin. Ekstrakty jądrowe zostały przygotowane i poddane EMSA. AP <0,05 vs. ścieżki i 3. Na ścieżce 4 dodano 100-krotny nadmiar molowy nieznakowanego NF-kB, aby wskazać swoistość dla NF-kB. (b) Po 8 tygodniach odżywiania myszy pozbawione apoE uśmiercano, a ekstrakty jądrowe przygotowywano z nerek (ścieżki 1-3) lub aorty (ścieżki 4. 6) dla EMSA. BP <0,01 vs. ścieżki i 3 oraz 4 i 6, odpowiednio. EMSA przeprowadzono na n = 7 myszach / diecie; Przedstawiono reprezentatywne eksperymenty. Przeprowadzono analizę densytometryczną; piksele uzyskane z analizy EMSA na próbkach traktowanych BSA lub próbkach tkanek od zwierząt otrzymujących dietę A arbitralnie przypisano wartości względnej 1. Ponieważ aktywacja NF-kB jest związana ze zwiększoną ekspresją genów centralnie zaangażowanych w aterogenezę (29), badaliśmy, czy indukcja HHcy była związana ze zwiększonym zapaleniem naczyń. Ponieważ poprzednie badania sugerowały, że kontrola transkrypcji / translacji ekspresji VCAM-1, ważna w wiązaniu zapalnych komórek jednojądrzastych ze ścianą naczynia, jest pośredniczona przynajmniej częściowo przez aktywację NF-kB (30. 31), my ocenili poziomy tej cząsteczki adhezyjnej in vivo. Myszy karmione dietą wzbogaconą w metioninę B wykazywały około 3,7-krotny wzrost ekspresji antygenu VCAM-1 w tkance aortalnej w porównaniu do myszy karmionych dietą A (Figura 3a). Rycina 3 Włączenie HHcy wzmaga naczyniową ekspresję VCAM-1 i RAGE. (a. d) VCAM-1. Myszy ApoE-null karmiono wskazaną dietą przez 8 tygodni. Usuwano aorty i przygotowywano lizaty. Białko lizatu (10 .g) poddano immunoblottingowi z kozim anty-VCAM-1 IgG (1 .g / ml). W a, AP <0,05 vs. ścieżki i 3. (bd) Immunohistochemię przeprowadzono przy użyciu IgG anty-VCAM-1 (8 .g / ml). (e. i) RAGE. W eE, HUVEC eksponowano na BSA, L-HC lub L-cysteinę (100 .M) przez 8 godzin. Lizaty przygotowano i poddano immunoblottingu z IgG przeciwko RAGE (2 .g / ml). AP <0,05 vs. ścieżki i 3. W punkcie f, przeprowadzono analizę immunoblottingu lizatów aortalnych z użyciem IgG anty-RAGE (2 .g / ml). AP <0,05 w stosunku do ścieżek i 3. (g. I) Immunohistochemię przeprowadzono przy użyciu anty-RAGE IgG (20. G / ml). W a, e, i f, znaczniki masy cząsteczkowej są wskazane po prawej stronie każdej plamki. Przeprowadzono analizę densytometryczną; jednostki pikselowe z tkanki aortalnej otrzymane od myszy otrzymujących dietę A lub HUVEC eksponowane na BSA arbitralnie przypisano wartości względnej wynoszącej 1. W aib przeprowadzono immunoblotting na n = 7 myszach / diecie; Przedstawiono reprezentatywne eksperymenty. W bd i gj, przeprowadzono immunohistochemię na n = 5 myszach / diecie; Przedstawiono reprezentatywne eksperymenty. Pasek skali, 50 .m. Immunohistochemia wykazała, że VCAM-1 był wyrażany w zmianach miażdżycowych myszy karmionych dietą A i B (Figura 3, b i c). Ponadto, wcześniejsze badania sugerowały, że promotor genu kodującego RAGE (32), wieloligowy receptor transdukcji sygnału nadrodziny immunoglobulin, połączony z propagacją prozapalnych zjawisk (24), posiadał funkcjonalne elementy wiążące dla NF-kB (33). . W warunkach in vitro inkubacja HUVEC z L-HC (100 .M) spowodowała około 2,8-krotny wzrost ekspresji antygenu RAGE przez immunoblotting w porównaniu z komórkami traktowanymi BSA lub L-cysteiną (Figura 3e). In vivo, tkanka aorty pobrana od myszy karmionych dietą B wykazywała około 4,5-krotny wzrost ekspresji RAGE w porównaniu z myszami otrzymującymi dietę kontrolną A (Figura 3f). Immunohistochemia wykazała, że ekspresja RAGE była zwiększona w zmianach miażdżycowych myszy karmionych dietą B w porównaniu z dietą A (odpowiednio Figura 3, h i g). EN-RAGE, członkowie rodziny S100 / kalgranuliny prozapalnych cytokin (34. 35) i ligandów przekazujących sygnał RAGE, zidentyfikowano w blaszkach miażdżycowych karmionych karmią przez myszy apoE-null (36). W obecności HHcy myszy karmione dietą B wykazywały około 3,7-krotny wzrost ekspresji antygenu EN-RAGE w aorcie w porównaniu z kontrolami, stosując immunoblotting (Figura 4a) [hasła pokrewne: szpital psychiatryczny lublin, polskie produkty spożywcze, eve online centrala ] [więcej w: eve online forum, mięśnie grzbietu anatomia, eve online centrala ]