Komórkowa odpowiedź immunologiczna związana z chorobą u cukrzyków typu 1 z immunodominującym epitopem insuliny czesc 4

Po 24 do 48 godzinach inkubacji w 37 ° C, 5% CO2, komórki zostały wypłukane i wykryto cytokiny za pomocą anty-ludzkiego IFN-y. (Endogen Inc.) lub anty-ludzkie IL-2, IL-4, IL-5 lub IL-13 (PharMingen Inc.) drugorzędowe biotynylowane mAb plus peroksydaza awidynowa. Roztwór substratu AEC (3-amino-9-etylokarbazol, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) zastosowano do rozwinięcia reakcji, którą zatrzymano przez przemycie płytki wodą. Plamki pochodzące z komórek wytwarzających cytokiny oceniano ilościowo za pomocą analizatorów immunologicznych i satelitarnych Satellite Series-1 (Autoimmun Diagnostika Inc., Strassberg, Niemcy). Oczyszczony test wiązania HLA-DQ. Wiązanie peptydu z HLA-DQA1 * 0301 / DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) oceniano stosując konkurencyjne hamowanie oznaczenia fluorometrycznego Europum, jak opisano wcześniej (26). Stężenie hamujące 50% (IC50) obliczono z krzywych wyparcia kompetycyjnego dla każdego peptydu i zastosowano jako oszacowanie powinowactwa wiązania peptydu z cząsteczkami HLA-DQ8. Wyniki Insulina B (9. 23) – odpowiedź proliferacyjna PBMC od pacjentów z cukrzycą typu o niedawnym początku. Epitop B (9-23) insuliny wydaje się być immunodominującym docelowym antygenem u myszy NOD (4. 7). Zbadaliśmy, czy epitop ten odegrał również rolę w cukrzycy typu u ludzi, określając, czy w limfocytach krwi obwodowej chorych na cukrzycę typu rozwinęły się odpowiedzi komórek na insulinę B (9. 23). Krótkoterminowe linie komórek T od 12 pacjentów z cukrzycą typu o niedawnym początku oraz od 13 osób bez cukrzycy z prawidłowym HLA lub wiekiem pacjentów z normalną kontrolą (C1-C13) i jeden krewny pierwszego stopnia wysokiego ryzyka (H5) poddano prowokacji insuliną B (9. 23) i oceniono proliferację. Te krótkoterminowe linie komórkowe wygenerowano w celu zwiększenia częstotliwości dowolnych komórek T specyficznych wobec B (9 (23)) przed oznaczeniami proliferacji, ponieważ częstotliwości komórek T specyficznych względem antygenu w świeżo izolowanych PBMC są zazwyczaj niskie. Dziesięciu z 12 pacjentów z cukrzycą odpowiedziało na B (9. 23) w sposób zależny od dawki (Figura 1) i w różnym stopniu (Tabela 4, średnia . SEM indeksu stymulacji [SI, jak opisano w legendzie do Tabeli 4] = 6,4 1,2), podczas gdy odpowiedź nie występowała u wszystkich osób bez kontroli cukrzycy (Tabela 4, średnia . SEM dla SI = 1,1. 0,1). Wartość SI większa niż 2 została uznana za pozytywną. Zwróć uwagę, że porównanie dopasowań pomiędzy rodzeństwem kontrolnym (tj. C11 i P1; C12, C13 i P2; i H5 i P12) i dopasowań HLA (C5 i P9; C11 i P1, P2; i H5 i P11, P12) podkreśla uderzające połączenie tej odpowiedzi B (9. 23) specyficznie z grupą cukrzycy typu 1. W niektórych przypadkach z kontrolnymi hodowlami osobników żywotność komórek wydawała się zmniejszać dramatycznie po pierwszym cyklu ponownej stymulacji, w którym to przypadku testy przeprowadzono po pierwszym cyklu stymulacji. Brak reaktywności u osób kontrolnych lub u dwóch pacjentów (tj. P8 i P10) nie został przypisany do śmierci komórki, ponieważ osoby te odpowiedziały na mitogen komórek T, PHA (Tabela 4). Dodatkowo, reaktywność B (9. 23) była specyficzna, ponieważ ci pacjenci nie reagowali na niespokrewnione peptydy kontrolne (dane nie przedstawione). Wyniki te pokazują, że większość (83%) pacjentów z cukrzycą, ale nie z grupą kontrolną HLA lub wiekiem, rozwinęło odpowiedź proliferacyjną na peptyd insuliny B (9. 23). Rycina Odpowiedź pacjenta z cukrzycą typu na peptyd insuliny B (9. 23). Łącznie 105 limfocytów T z krótkoterminowych linii komórkowych PBMCs traktowanych B (9. 23) od pacjentów z cukrzycą typu (tj. P1. P12) zaszczepiono na studzienkę 96-studzienkowej okrągłodennej płytki z 7 x 104 napromieniowane autologiczne PBMC w obecności lub nieobecności różnych stężeń peptydu insuliny B (9. 23). Komórki hodowano przez 5 dni, w których do każdej studzienki pulsowano [3H] tymidynę przez końcową 18-20 godzin, i policzono ilość włączonej radioaktywności. Wartości we wszystkich panelach to średnia wartość cpm. SEM z trzech hodowli z jednego doświadczenia reprezentatywnego dla co najmniej dwóch eksperymentów dla wszystkich pacjentów. Tabela 4 Odpowiedź proliferacyjna pacjentów z cukrzycą typu i osób zdrowych bez cukrzycy na prezentację peptydów B (9-223) A insuliny B (9-223) przez cząsteczki HLA klasy II. Insulina B (9. 23) jest restrykcyjnym immunodominowanym epitopem HLA klasy II dla patogennych komórek T CD4 + izolowanych z trzustek młodych myszy NOD (4. 6). Aby potwierdzić, że odpowiedź B (9. 23) u pacjentów z cukrzycą typu jest ograniczona do klasy II, limfocyty T z B (9. 23) -reaktywnych linii komórkowych od pacjenta P2, który jest homozygotyczny pod względem HLA-DR4 (DRB1 * 0402 / 0405) i allele DQ8 (DQB1 * 0302) poddano prowokacji za pomocą B (9. 23) w obecności lub braku przeciwciał przeciwko cząsteczkom DR lub DQ i oceniano proliferację (Figura 2)
[podobne: eve online polska, olej z awokado właściwości, eve online poradnik ]
[więcej w: olej z awokado właściwości, ostrzykiwanie osoczem cena, szpital bytom żeromskiego ]