Mutacje NPHS2 w późnej fazie ogniskowej segmentowej stwardnienia kłębuszków nerkowych: R229Q jest powszechnym allelem związanym z chorobą cd

Genotypy określono przez powielenie PCR, z jednym ze starterów znakowanych albo [32P] -dATP lub barwnikiem fluorescencyjnym, w standardowych warunkach, a następnie elektroforeza żelowa produktu. Kolejność markerów i przybliżone odległości uzyskano z baz danych Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge, Massachusetts; http://www.genome.wi.mit.edu) oraz z bazy danych Genome (http://gdbwww.gbd.org). Haplotypy określano ręcznie poprzez kontrolę genotypów określonych u rodziców i / lub rodzeństwa. Przeanalizowaliśmy 91 dorosłych osobników z sporadycznym FSGS dla polimorfizmu R229Q. Przeanalizowaliśmy również DNA z kilku populacji kontrolnych: (a) 124 osoby bez znanej choroby nerek (głównie małżonkowie pacjentów z FSGS), (b) 16 osób afrykańskich i 16 osób z Afryki i Ameryki (z powodu dużej częstości występowania FSGS w tych populacjach), oraz (c) 49 osób z Brazylii (jako kontrola dla największej rodziny, FS-W). Eksperyment wiązania nefryny. Wklonowaliśmy klon cDNA pełnej długości nefryny w wektor pcDNA3.1 / V5 / His-TOPO (Invitrogen Corp.). Transfekowaliśmy ludzką embrionalną komórkę nerkową 293 konstruktem cDNA. Transfekowane komórki HEK293 poddano lizie z buforem A (zawierającym 1% Triton X-100, 10 mM imidazol i inhibitory proteazy). Oczyszczanie białka znakowanego His przeprowadzono stosując agarozę Ni-NTA (QIAGEN Inc.) zgodnie z protokołem producenta. Stężone białko rozpoznano przez poliklonalne przeciwciało przeciw nefrynie (opisane w odnośniku 20). Wytworzyliśmy znakowanego 35S mutanta typu dzikiego, mutanta R229Q i zmutowanego podociny R291W przez transkrypcję / translację in vitro, jak opisano w ref. 7. Zmutowane klony podociny uzyskano z pełnej długości ludzkiego cDNA klonu NPHS2 za pomocą ukierunkowanej mutagenezy z użyciem zestawu QuickChange (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Produkty transkrypcji / translacji in vitro znormalizowano do równej liczby produktów translacji na objętość. Zastosowano taką samą objętość (20 (ll) znakowanego in vitro. Translacji dzikiego typu, R229Q, a także, w dwóch doświadczeniach, podociny R291W. Do każdej reakcji 20 ul dodano 800 ul immunomiksu strąceniowego, składającego się z 0,2% (wag./obj.) SDS, 10% (wag./obj.) BSA, mM EDTA, mM PMSF i 5 mM kwasu indolooctowego. w immunomiksie do przemywania (1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu w PBS). Po wstępnej absorpcji przez inkubację z 10 .l surowicy królika przed immunizacją przez 2 godziny w 4 ° C, dodaliśmy 50 .l kulek białka A-Sepharose CL-4B (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) do reakcji w celu wyeliminowania niespecyficznego wiązania. Po delikatnym kołysaniu w 4 ° C przez 2 godziny kulki usunięto przez krótkie odwirowanie. Tę inkubację z perełkami i płukaniem powtórzono. Supernatanty następnie inkubowano przez noc z przeciwciałem przeciw nefrynie (20) i (ig oczyszczonej nefryny. Dodaliśmy 50 .l kulek białka A-Sepharose CL-4B, a próbki inkubowano 2 godziny w temperaturze 4 ° C z delikatnym kołysaniem. Perełki zebrano przez odwirowanie przy 16,000 g w 4 ° C przez 20 minut. Osad przemywano serią buforów, aby wyeliminować niespecyficzne wiązanie. Seria płukań była następująca: raz za pomocą immunomiksu płuczącego, następnie za pomocą 2 M KCl w immunomiksie do przemywania, następnie za pomocą buforu Neufeld (0,05% [wag./obj.] NP-40, 0,1% [wag./obj.] SDS, 0,6 M NaCl , 10 mM Tris-HCl [pH 8,5]), a następnie dwukrotnie z rozcieńczonym 1:10 PBS. Osad zebrano przez odwirowanie. Kompleksy immunologiczne ekstrahowano z peletki przez ogrzewanie w temperaturze 95 ° C przez 5 minut z 60 .l buforu Laemmli, a następnie wirowanie przy 13000 rpm przez 30 minut. Klarowny supernatant poddano 10% PAGE w obecności SDS w warunkach redukujących. Żel przeniesiono na nitrocelulozę i wystawiono na błonę do autoradiografii. Ten sam blot zastosowano do immunodetekcji ilości wytrąconego białka nefryny w każdej reakcji. Jako kontrolę negatywną, doświadczenie to przeprowadzono również w nieobecności dodanej nefryny. Densytometrię przeprowadzono przy użyciu oprogramowania NIH Image (21). Wyniki Analiza sekwencji genu NPHS2. Przeanalizowaliśmy amplikony PCR każdego z ośmiu egzonów NPHS2 przez bezpośrednie sekwencjonowanie i / lub DHPLC, stosując genomowy DNA jako matrycę. Stwierdziliśmy, że wszystkie dotknięte chorobą osoby z dużej rodziny (FS-W) są heterozygotami złożonymi dla dwóch niezależnych substytucji missenowych: przejście G. A przy nukleotydzie 755, przewidywanie substytucji Argylogn w kodonie 229 (ekson 5, R229Q), i przejście C. T przy nukleotydzie 941, przewidywanie podstawienia Arg. Trp w kodonie 291 (ekson 7, R291W; Figura 1). Ta pierwsza jest substytutem nukleotydu missense; ta ostatnia została wcześniej opisana we wczesnej wersji FSGS (9)
[więcej w: szpital bytom żeromskiego, eve online poradnik, eve online trial ]
[patrz też: eve online poradnik, eve online trial, eve online polska ]