Nadekspresja Cyclin D1 i inaktywacja p53 unieśmiertelniają pierwotne keratynocyty doustne za pomocą mechanizmu niezależnego od telomerazy ad 5

Nieśmiertelne komórki ludzkie utrzymują swoje telomery za pomocą jednego z dwóch znanych mechanizmów: aktywacji telomerazy lub aktywacji alternatywnej ścieżki w wydłużaniu telomerów (ALT). Aby dokładniej zbadać mechanizmy unieśmiertelniania w keratynocytach jamy ustnej, przebadaliśmy macierzyste komórki OKF6 i pochodne dla aktywności telomerazy. Aktywność telomerazy była nieobecna we wszystkich komórkach OKF6 (OKF6, OKF6-LacZ, OKF6-D1, OKF6-P p53, OKF6-D1 / P53), w tym nieśmiertelne szczepy komórek OKF6-D1 / P53 (Figura 4). Pomiary długości telomerów metodą Southern blot z sondą swoistą dla telomerowych powtórzeń ssaków (TRF) wykazały postępujące skracanie telomerów, które korelowały z replikacyjnym wydłużaniem okresu życia doustnych keratynocytów. Rodzicielskie komórki OKF6 wykazywały dłuższą średnią długość telomerów niż komórki OKF6-D1 i OKF6-p p53, które zachowały dłuższe telomery niż komórki OKF6-D1 / p53 przy 120 PD (Figura 5). Co ciekawe, komórki OKF6-D1 / p53 przy 160 PD wykazały wydłużenie długości telomerów mierzone przez TRF z heterogenicznym wydłużaniem, w tym bardzo długimi telomerami do 40 kb (Figura 5). Tak więc, szczepy komórek OKF6-D1 / P53 uzyskały zdolność do utrzymywania swoich telomerów w nieobecności aktywności telomerazy przy PD120a160. Figura 4 Aktywność telomerazy w macierzystych i pochodzących doustnych keratynocytach. Wyciągi komórkowe (500 ng i 50 ng) komórek OKF6, OKF6-lacZ, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 badano pod kątem aktywności telomerazy przy użyciu testu TRAP opartego na PCR. Próbki poddane obróbce cieplnej (HT) służyły jako kontrola negatywna, a komórki OKF6 transdukowane do ekspresji hTERT (13) zastosowano jako kontrolę pozytywną. IC jest wewnętrzną kontrolą PCR w celu wykazania braku inhibitorów PCR w ekstraktach komórkowych. Figura 5 Długość telomeru w macierzystych i pochodzących doustnych keratynocytach. (a) Długość telomerów dla komórek OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 (120 PD) analizowano przez hybrydyzację genomowego DNA z określoną sondą oligonukleotydową. Komórki OKF6-hTERT służyły jako kontrola. (b) Długość telomerów dla komórek OKF6-D1 / P53 (120 PD) i OKF6-D1 / P53 (160 PD). Standard rozmiaru wskazany jest po lewej stronie. Szeroki rozmaz w OKF6-D1 / p53 (160 PD) rozpoczyna się przy długości telomerów 40 kb. Aby ocenić zdarzenia rekombinacji chromosomów w komórkach OKF6-D1 / P53, przeprowadzono analizę kariotypu przy różnych czasach PD. To ujawniło aneuploidię i spójne przegrupowania chromosomów zgodne z selekcją zmian chromosomalnych w komórkach z krytycznie krótkimi telomerami (Tabela 1). Tabela Kariotyp w doustnych keratynocytach Charakterystyka wzrostu unieśmiertelnionych komórek OKF6-D1 / p53. Następnie ustaliliśmy, czy proces unieśmiertelniania komórek OKF6-D1 / p53 zaburza specyficzne mechanizmy kontroli wzrostu keratynocytów. Badaliśmy zdolność komórek OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 do wzrostu w pożywce o obniżonym czynniku wzrostu. Nieimmobilizowane doustne keratynocyty (OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53) całkowicie zachowały zależność od czynników wzrostu (Figura 6) i nie rosły w pożywce o obniżonym czynniku wzrostu. Przeciwnie, unieśmiertelnione szczepy komórek OKF6-D1 / p53 wykazywały zdolność proliferacyjną, chociaż zmniejszoną do 40% (Figura 6). Figura 6 Zależność od czynnika wzrostu macierzystych i uzyskanych doustnych keratynocytów. Komórki OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 wysiewano w niskiej gęstości albo w czynniku suplementowanym czynnikiem wzrostu (+ czynniki wzrostu) albo w zredukowanym (czynniku wzrostu). Komórki zliczano 7. 9 dni później, a wzrost w tych warunkach obliczano jako PD na dzień. Przedstawione wyniki są średnią z trzech eksperymentów. Aby ocenić, czy unieśmiertelnione doustne keratynocyty mogły zostać poddane złośliwej transformacji, wstrzyknięto szczepy komórek OKF6-D1 / P53 do nagich myszy z niedoborem odporności. Podobnie jak w przypadku komórek OKF6 służących jako kontrole negatywne, po 3 miesiącach obserwacji nie zaobserwowano żadnych nowotworów ze szczepami komórek OKF6-D1 / P53 (Tabela 2). Jako kontrolę pozytywną, w tym teście ludzkim nowotworem nabłonkowym linie SCC15 (doustnie) i TE12 (przełykowo) łatwo tworzyły guzy (Tabela 2). Tabela 2 Formowanie nowotworów u myszy z niedoborem immunologicznym. Dyskusja Jedną z głównych różnic pomiędzy normalnymi komórkami ssaków i komórkami nowotworowymi jest ich potencjał proliferacyjny. Normalne komórki ssaków mnożą się dla ograniczonej liczby PD, a następnie przechodzą do stanu niedostępnego znanego jako starzenie (3). Komórki nowotworowe są zdolne do proliferacji w nieskończoność i dlatego są określane jako unieśmiertelnione. Komórkowa immortalizacja jest niezbędnym krokiem w kierunku złośliwej transformacji normalnych komórek. Ważnymi zmianami genetycznymi związanymi z unieśmiertelnieniem są utrata funkcji p53 i pRb oraz aktywacja mechanizmu konserwacji telomerów, zazwyczaj telomerazy (7). To wirusowe onkoproteiny, takie jak HPV16 E6 i E7, a także duży antygen T SV 40, przyczyniają się do unieśmiertelniania, już wskazują, że zaangażowane są zarówno szlaki p53, jak i pRb (15, 16)
[więcej w: rezonans magnetyczny kościerzyna, dawstwo komórek jajowych, gatunek tłustego śledzia ]
[więcej w: rezonans magnetyczny kościerzyna, eve central, ostrzykiwanie osoczem cena ]