Onkogenna fuzja AKAP9-BRAF jest nowym mechanizmem aktywacji szlaku MAPK w raku tarczycy ad 7

Produkt PCR poddano elektroforezie w żelu agarozowym, oczyszczono z żelu i wklonowano do wektora pCR-XL-TOPO (Invitrogen Corp.). Kilka klonów zostało całkowicie zsekwencjonowanych. Genomową fuzję AKAP9-BRAF amplifikowano ze starterami 5a-GCAACTCAACCAAGTGAAAATG-3. i 5 (3-GGTTGATCCTCCATCACCAC-3 (3, dając produkt o w przybliżeniu 2,4 kb, a cDNA z odwrotnym produktem fuzyjnym amplifikowano ze starterami 5a-ACCCGCCTCGGACTCTATT-3. i 5a-GTTGGGCTTCCATCTGTAGC-3y, dając produkt o wielkości 242 pz. Western blot i immunohistochemia. Zamrożone tkanki z brodawkowatych raków zastosowano do analizy Western, co przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (49). Wprowadziliśmy 50 .g białka na 5% żelu poliakrylamidowym. Po przeniesieniu membrany inkubowano z przeciwciałami poliklonalnymi BRAF anty-C (Raf-B, C-19, Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub monoklonalnymi przeciwciałami AKAP9 (AKAP450; BD Biosciences) anty-N-końcowymi. To samo przeciwciało AKAP9 w rozcieńczeniu 1:50 zastosowano do analizy immunohistochemicznej, którą przeprowadzono na skrawkach parafinowych po całonocnej obróbce wstępnej w buforze boranowym z zastosowaniem detekcji immunoperoksydazy awidyna-streptawidyna. Królicze przeciwciało poliklonalne królicze anty-tubuliny było dostarczone przez K. Fukasawa (University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio, USA) (50) i stosowano je w rozcieńczeniu 1: 800 na skrawkach parafinowych po wstępnej obróbce w buforze boranowym. Test kinazy in vitro. Komórki COS7 przejściowo kotransfekowano albo wektorem pEFP, albo znakowanym BRAFWT zawierającym myc BRAFWT, AKAP9-BRAF lub BRAFV600E i pBabe puro lub pBabe puro . HRASG12V stosując Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.). Po 48 godzinach przygotowano ekstrakty komórkowe, poddano immunoprecypitacji mysim przeciwciałem anty-myc-IgG (Upstate Cell Signaling Solutions) i oznaczono aktywność kinazy zgodnie z zaleceniami producenta, stosując MEK1 jako substrat i bakteriologicznie oczyszczonego MEK1, i metodą Western blotting z przeciwciałem pMEK1 jako odczytaną próbką. obecnie (zestaw testowy kinazy B-RAF, systemy sygnalizacji upstate cell). Aby określić wpływ mutantów BRAF na endogenną fosforylację ERK1 / 2 inkubowaliśmy pule stabilnie transfekowanych komórek przez 12 godzin bez surowicy przed przygotowaniem lizatu. Lizaty odwirowano, zebrano supernatant i 100 .g ekstraktu poddano SDS-PAGE. Białka przeniesiono na błonę nitrocelulozową i poddano analizie Western blot przeciwciałami anty-fosfo-ERK1 / 2, anty-total ERK1 / 2 lub anty-BRAF (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Testy transformacyjne. Do testów ostrości, komórki NIH3T3 transfekowano pustym wektorem lub wskazanymi plazmidami ekspresyjnymi BRAF i H-RAS z użyciem lipofektaminy. Po 2 dniach komórki podzielono na sześć 100-mm płytek i inkubowano z DMEM zawierającym 5% surowicy cielęcej przez 21 dni. Komórki zabarwiono 0,4% fioletu krystalicznego i policzono ogniska. W przypadku doświadczeń z ksenoprzeszczepami myszy, komórki NIH3T3 kotransfekowano wektorem pBabe puro i pEFP, pFPa myc BRAFWT, pEFPa AKAP9-BRAF, pEFP . myc BRAFV600E lub pBabe puroAH-RASG12V i masą wybraną przez inkubację z DMEM zawierającym 5% cielęcej surowicy i .g / ml puromycyny przez 3 tygodnie. Łącznie 106 zebranych komórek wstrzyknięto nagim myszom. Zwierzęta zabito po 2 tygodniach, a guzki większe niż 5 mm oceniono jako dodatnie. Analiza mutacji. W celu wykrycia fuzji AKAP9-BRAF, amplifikacja cDNA została osiągnięta przez PCR przy użyciu starterów zlokalizowanych w eksonie 8 AKAP9 (Ex8A, 5a -AGCAAGAACAGTTATTATTTGGA-3a) i eksonie 10 z BRAF (Ex10B, 5a-GCAGACAAACCTGTGGTTGA-3.) , z oczekiwanym produktem o wartości 181 pz. Produkty PCR poddawano elektroforezie na żelu agarozowym i prążki wizualizowano przez barwienie bromkiem etydium (zamrożone tkanki) lub przez przeniesienie do filtra nylonowego i hybrydyzację z wewnętrzną sondą oligonukleotydową (PR, 5a-AAACTTCAGAAAGAACTCAATGTACTT-3 .) znakowaną 50. Ci [a-32P] -ATP (tkanka zatopiona w parafinie). Wykrywanie mutacji BRAF V600E przeprowadzono z DNA przy użyciu analizy krzywej topnienia metodą PCR w czasie rzeczywistym i fluorescencji, jak wcześniej podano (51), lub z cDNA przy użyciu RT-PCR w czasie rzeczywistym ze starterami 5. -CGACAGACTGCACAGG-3. i 5. -TGACTTCTGGTGCCAT-3. i te same sondy. Analiza statystyczna. Porównanie między grupami przeprowadzono za pomocą dokładnego testu Fishera Fishera. Różnice uznawano za istotne, gdy P było mniejsze niż 0,05. Podziękowania Niniejsze badanie zostało wsparte grantem NIH R01 CA88041 oraz grantem Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego RSG-03-027-01-CCE (dla YE Nikiforov), dotacji NIH R01 CA50706 (dla JA Fagin), dotacji z American Cancer Society Ohio rozdział 06001011 ( JA Knauf) oraz dotację z Deutsche Krebshilfe, Bonn, Niemcy (na rzecz HM Rabes). Zbieranie próbek tkanek było częściowo wspierane przez grant NIH (PHS M01 RR08084) oraz poprzez Spółdzielczą Sieć Tkanek Ludzkich finansowaną przez National Cancer Institute Dziękujemy Kenjimu Fukasawie za przeciwciała przeciw .-tubuliny, Mickeyowi Croyle owi za pomoc techniczną oraz Richardowi Maraisowi za wektory ekspresyjne BRAFWT i BRAFV600E. Przypisy Patrz odnośny komentarz od strony 20. Niestandardowe skróty: BAC, sztuczny chromosom bakteryjny; FISH, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; MEK, kinaza MAPK / ERK; ORF, otwarta ramka odczytu; PAC, sztuczny chromosom P1; PKA, kinaza białkowa A; RACE, szybka amplifikacja końców cDNA; RBD, domena wiążąca RAS-GTP; Podjednostka regulacyjna RII, II typu. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[podobne: szpital bytom żeromskiego, eve online poradnik, rezonans magnetyczny kościerzyna ]
[więcej w: rezonans magnetyczny kościerzyna, eve central, ostrzykiwanie osoczem cena ]