Onkogenna fuzja AKAP9-BRAF jest nowym mechanizmem aktywacji szlaku MAPK w raku tarczycy ad

Możliwość udziału BRAF w rearanżacji chromosomów badano metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Kontig klonów sztucznego chromosomu 3 P1 o wielkości około 330 kb, obejmujący cały gen BRAF, złożono do użycia jako sondy (Figura 1A). Łagodne komórki tarczycy wykazały zgodnie z oczekiwaniami 2 sygnały. Analiza 32 nowotworów brodawkowatych tarczycy wykazała obecność guza zawierającego 3 sygnały, podczas gdy następna hybrydyzacja z sondą centromerową 7 chromosomu wykazała obecność 2 kopii chromosomu (Figura 1B). Ponieważ podział jednego sygnału BRAF doprowadził do powstania pary sygnałów znajdujących się we względnie stałej odległości od siebie, prawdopodobnym mechanizmem tego zdarzenia była inwersja wewnątrz chromosomów. Figura 1: Identyfikacja przegrupowania genu BRAF. (A) Region genomowy na 7q zawierający gen BRAF i pozycję klonów PAC użytych jako sonda dla FISH. (B) Jądro międzyfazowe z guza indeksu pokazujące podział sygnału BRAF (czerwony) i zachowanie 2 sygnałów centromerowych chromosomu 7 (zielony), co wskazuje na przegrupowanie genu BRAF. Identyfikacja i charakterystyka partnera fuzyjnego. Identyfikacja partnera fuzyjnego została osiągnięta przez 5. szybka amplifikacja końców cDNA (RACE) za pomocą nowotworowego poli (A) + RNA i puli starterów zaprojektowanych wzdłuż 3. koniec genu BRAF. Produkty RACE zostały zsekwencjonowane, a kilka z nich ujawniło fuzję między eksonem 9 z BRAF i eksonem 8 genu kodującego kotwicę 9 kinazy A (AKAP9) (Figura 2A). Potwierdzenie fuzji uzyskano za pomocą RT-PCR ze starterami umiejscowionymi w eksonie 8 AKAP9 i eksonie 10 z BRAF, co dało oczekiwany produkt o wielkości 181 pz. Genomowy DNA zastosowano do PCR w celu identyfikacji fuzji na poziomie genomowym, który stwierdzono pomiędzy nukleotydem 364 intronu AKAP9 i nukleotydem 4,930 intronu BRAF 8. Odwrotny produkt genu fuzyjnego zidentyfikowano następnie za pomocą RT-PCR z użyciem cDNA guza. , wskazując na odwrotny charakter przegrupowania. Dalsze potwierdzenie otrzymano przez dwukolorowe FISH z sondami odpowiadającymi genom BRAF i AKAP9 (Figura 2B). Ponieważ gen BRAF znajduje się na chromosomie 7q34 (18) i AKAP9 na 7q21. Q22 (19. 21), fuzja AKAP9-BRAF jest wynikiem inv (7) (q21. 22q34) (Figura 2C). Używając primerów znajdujących się w obrębie 5. i 3. nieulegający translacji region odpowiednio AKAP9 i BRAF, sekwencję cDNA kodującą AKAP9-BRAF amplifikowano z guza, klonowano do wektora pCR-XL-TOPO i sekwencjonowano (numer dostępu GenBank AY803272). Analiza sekwencji (całkowity rozmiar 4 547 pz) ujawniła otwartą ramkę odczytu (ORF) o wielkości 4747 bp, zawierającą eksony (8 z AKAP9 połączonego w ramce z eksonami 9 (1818 z BRAF (figura 2D). W oparciu o znane sekwencje nieulegających translacji regionów obu genów przewidywana długość pełnego cDNA AKAP9-BRAF wynosi 4 849 bp. Cztery warianty transkryptu ludzkiego AKAP9 zidentyfikowano uprzednio w oparciu o kilka różnic w regionie kodującym. Sekwencja AKAP9 chimerycznego cDNA nie posiadała 36 nukleotydów w pozycji 269. 304 transkryptu w wersji (numer dostępu w GenBank NM_147171), co wskazuje, że odpowiada on transkrypcji w wersji 2 lub 3 genu. W wielu reakcjach RT-PCR nie wykryto żadnych wariantów splicingowych transkryptu fuzyjnego w cDNA guza. Analiza Western blot guza przy użyciu przeciwciała do C-końca BRAF wykazała prążek około 170 kDa, odpowiadający przewidywanej masie cząsteczkowej 172 kDa dla białka fuzyjnego (Figura 2E). Ten sam prążek został wykryty z przeciwciałem przeciwko N-końcowi AKAP9. Figura 2BRAF jest rekombinowany z genem AKAP9 i powoduje ekspresję białka fuzyjnego. (A) Sekwencja 5. Produkt RACE pokazujący punkt fuzji między AKAP9 i BRAF. (B) Potwierdzenie wzajemnego łączenia przez FISH z sondami odpowiadającymi genom BRAF (czerwony) i AKAP9 (zielony). (C) Fuzja jest wynikiem paracentrycznego inwersji chromosomalnego inv (7) (q21. 22q34). Chr., Chromosom. (D) Genomowa struktura genów BRAF i AKAP9 pokazująca lokalizację punktów przerwania (strzałki) i organizację chimerycznego cDNA. Egzony są reprezentowane przez ramki i introny liniami. Liczby powyżej wskazują liczby egzonów. (E) Analiza Western blot z użyciem przeciwciała BRAF (po lewej) i przeciwciała AKAP9 (po prawej), pokazującego białko w przybliżeniu 170 kDa, odpowiadające przewidywanej masie cząsteczkowej białka fuzyjnego w przypadku indeksu (numer 02-28). Trzy inne brodawkowate nowotwory (T1. T3) pokazano dla porównania. AKAP9 typu dzikiego ma rozmiar 453 kDa i nie wykryto go w tej analizie Western blot. Gen AKAP9 typu dzikiego koduje białko 453-kDa zdolne do wiązania podjednostki regulacyjnej typu II (RII) kinazy białkowej A (PKA), jak również innych białek sygnałowych, kotwicząc je z centrosomem i aparatem Golgiego (19. 21).
[patrz też: olej z awokado właściwości, rezonans magnetyczny kościerzyna, pierwsza pomoc oparzenia ]
[podobne: eve forum, nowotwór pęcherzykowy tarczycy, plazminogen ]