Onkogenna fuzja AKAP9-BRAF jest nowym mechanizmem aktywacji szlaku MAPK w raku tarczycy cd

Kilka izoform powstających w wyniku alternatywnego składania ulega selektywnej ekspresji w większości ludzkich tkanek przy małej obfitości (19, 20). Białko AKAP9 lokalizuje się za pomocą immunofluorescencji jako pojedyncza okołojądrowa kropka i część otaczającej rozproszonej fluorescencji, odpowiednio odpowiadającej centrosomowi i przedziałom Golgiego, w komórkach interleukowej HeLa i SaOS2 osteosarcoma (19, 20). W oparciu o sekwencję chimerycznego cDNA przewiduje się, że białko fuzyjne nie będzie zawierało 2 przypuszczalnych regionów wiążących RII i domeny lokalizacji centrosomu AKAP9 (20, 22, 23). W brodawkowatych raku tarczycy, ujemnym pod względem fuzji oraz w nienowotworowej tkance tarczycy, ekspresja AKAP9 była łatwo wykrywalna za pomocą RT-PCR (dane nie przedstawione), a białko było postrzegane jako pojedyncza okołojądrowa kropka z lekkim rozlanym barwieniem cytoplazmatycznym (Figura 3A) . W nowotworze eksprymującym białko AKAP9-BRAF, okoń-jądro nie było już możliwe do zidentyfikowania, podczas gdy w cytoplazmie obserwowano rozproszone barwienie (Figura 3B). Jednak obecność nienaruszonych centrosomów w komórkach nowotworowych została potwierdzona przez immunohistochemię z przeciwciałem przeciwko centrosomalnej białko tubuliny (dane nie przedstawione). Jest to zgodne z brakiem centrosomalnej domeny lokalizacyjnej AKAP9 w białku fuzyjnym, co zapobiega jego preferencyjnemu celowaniu do przedziału centrosomalnego. Figura 3 Pozakomórkowa lokalizacja AKAP9 i AKAP9-BRAF wykrywana przez immunohistochemię z przeciwciałem AKAP9. (A) W brodawkowatym raku tarczycy, ujemnym dla fuzji, białko jest przeważnie ukierunkowane na centrosomy, postrzegane jako pojedyncza kropka okołojądrowa. Występuje także słabe, rozproszone barwienie cytoplazmatyczne. (B) Guz eksprymujący AKAP9-BRAF ujawnia rozproszony rozkład cytoplazmatyczny białka chimerycznego i kropka okołojądrowa nie jest już widoczna. Przesunięcie lokalizacji obejmuje tylko komórki nowotworowe, ale nie sąsiadujące komórki śródbłonka naczyniowego, które zachowują kropkowany wzór barwienia (strzałka). Powiększenie, × 200. Charakterystyka funkcjonalna fuzji AKAP9-BRAF. Gen ludzkiego BRAF typu dzikiego koduje kinazę serynowo-treoninową o 84 kDa w szlaku MAPK (16, 24). Strukturalnie, BRAF, podobnie jak inne kinazy RAF, zawiera 2 wysoce konserwatywne N-końcowe domeny regulatorowe, CR1 i CR2, które pośredniczą w autoagresji BRAF i C-końcowej domeny kinazy białkowej (CR3). CR1 obejmuje domenę wiążącą RAS-GTP (RBD), która pośredniczy w wiązaniu z RAS, wyzwalając rekrutację białka do błony komórkowej i aktywację kinazy (25). W oparciu o sekwencję cDNA przewiduje się, że białko fuzyjne AKAP9-BRAF nie zawiera N-końcowych domen regulatorowych BRAF, w tym RBD, i zachowuje nienaruszoną domenę kinazy. Utrata domen regulatorowych powinna prowadzić do konstytutywnej aktywacji kinazy BRAF w sposób niezależny od RAS. Scharakteryzowaliśmy aktywność kinazy białka fuzyjnego AKAP9-BRAF przez przejściową transfekcję cDNA dla genu AKAP9-BRAF, BRAFV600E lub BRAF typu dzikiego do komórek COS7, stosując bakteryjnie oczyszczony MEK1 jako substrat do fosforylacji (fig. 4A). Podstawowa aktywność kinazy BRAF białka fuzyjnego była 6-krotnie większa niż aktywność BRAFWT i nie zwiększała się dalej przez koekspresję aktywowanego RAS. Podstawowa aktywność BRAFV600E również wzrosła, ale w mniejszym stopniu i została nieznacznie zwiększona przez H-RASG12V. Przeciwnie, H-RASG12V zwiększył aktywność kinazy BRAFWT około 2,5-krotnie. Białko fuzyjne stymulowało endogenną fosforylację ERK1 / 2 w podobnym stopniu jak BRAFV600E w połączonych stabilnie transfekowanych komórkach NIH3T3, podczas gdy nadekspresja BRAFWT nie dawała zauważalnego efektu (Figura 4B). Figura 4 Białko chimeryczne AKAP9-BRAF ma zwiększoną aktywność kinazy BRAF i powoduje transformację komórek NIH3T3. (A) Aktywność kinazy in vitro BRAFWT znakowanego myc, AKAP9-BRAF i BRAFV600E pod nieobecność lub obecność H-RASG12V w komórkach COS7. Aktywność kinazy BRAF mierzono w immunoprecypitatach myc-IgG przy użyciu fosforylacji substratu MEK1 jako odczytu. Każdą próbkę badano w trzech powtórzeniach, a słupki przedstawiają standardowe odchylenia od średniej. Podobne wyniki uzyskano w 2 niezależnych transfekcjach. (B) Western blot lizatu z komórek trwale transfekowanych pEFP, pEFP-BRAFWT, pEFP . AKAP9-BRAF, pEFP-BRAFV600E lub pBabe puro | H-RASG12V sondowanymi przeciwciałami przeciwko fosfo-ERK1 / 2 (pERK), całkowita ERK (tERK) lub C-koniec BRAF. Podobne wyniki uzyskano w 3 dodatkowych niezależnych eksperymentach. (C) Tworzenie ognisk komórek NIH3T3 transfekowanych pEFP-BRAFWT, pEFP . AKAP9-BRAF, pEFP-BRAFV600E lub pBabe puro-H-RASG12V. Słupki oznaczają średnią liczbę ognisk na płytkę z 6 płytek
[podobne: eve online polska, przelicznik gram na szklanki, szpital psychiatryczny lublin ]
[podobne: dom zdrojowy szczawno, eve online spolszczenie, eve pl ]