Onkogenna fuzja AKAP9-BRAF jest nowym mechanizmem aktywacji szlaku MAPK w raku tarczycy czesc 4

Podobne wyniki uzyskano w 2 niezależnych eksperymentach. Zdolność białka fuzyjnego AKAP9-BRAF do indukowania transformacji badano w teście ogniskowania komórek NIH3T3 (Figura 4C). Vector i BRAFWT stransformowały komórki przy bardzo niskiej wydajności. AKAP9-BRAF wykazywał najwyższą aktywność transformacji w tym teście, a następnie H-RASG12V i BRAFV600E. Ponadto, komórki NIH3T3 trwale transfekowane pustym wektorem, BRAFWT, AKAP9-BRAF, BRAFV600E i H-RASG12V badano pod kątem rakotwórczości u myszy nagich. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu 106 komórek utworzono guzy o średnicy co najmniej 5 mm z pełną penetracją (6 z 6 zwierząt, powtórzono w 2 niezależnych eksperymentach) dla konstruktów AKAP9-BRAF, BRAFV600E i H-RASG12V, podczas gdy wektor i BRAFWT nie doprowadził do rozwoju nowotworów (0 naszych 6 zwierząt). Wyniki te pokazują, że fuzja AKAP9-BRAF prowadzi do aktywacji kinazy BRAF i transformacji komórek NIH3T3. Częstość występowania fuzji AKAP9-BRAF i mutacji punktowej BRAF w raku tarczycy. Aby określić częstość występowania fuzji AKAP9-BRAF w różnych populacjach, wykorzystano RT-PCR ze starterami flankującymi punkt fuzji do zbadania dużej serii brodawkowatych raków tarczycy (Tabela 1). W grupie 102 sporadycznych guzów brodawkowatych nie stwierdzono dodatkowego przypadku fuzji. Zbadaliśmy również brodawkowe raki z 2 kohort białoruskich dzieci i młodzieży narażonych na promieniowanie po awarii jądrowej w Czarnobylu w 1986 roku. Spośród 28 nowotworów, które rozwinęły się 5. 6 lat po ekspozycji, 3 (11%) było dodatnich pod względem fuzji, podczas gdy 64 nowotwory rozwój 9-12 lat po wypadku były ujemne (wykres 5A). Bloki parafinowe były dostępne do analizy immunohistochemicznej z przeciwciałem AKAP9 w 2 z 3 pozytywnych przypadków. Oba przypadki wykazały przesunięcie w subkomórkowej lokalizacji AKAP9 ze schematu centrosomalnego obserwowanego w sąsiadującej nienowotworowej tkance tarczycy w celu rozproszenia rozkładu cytoplazmatycznego w komórkach nowotworowych (Figura 5B). Figura 5 Analiza guzów po Czarnobylu, które rozwinęły się 5. 6 lat po ekspozycji. (A) Southern błot produktów RT-PCR amplifikowano ze starterami Ex8A i Ex10B i hybrydyzowano z PR sondy, wykazując 2 pozytywne przypadki (C32 i C27). Inne próbki guza są negatywne (C13, C23, C24, C18 i C31). NC, kontrola negatywna; PC, kontrola pozytywna (indeksowanie). (B) Analiza immunohistochemiczna nowotworu C32 z przeciwciałem AKAP9 wykazującym przesunięcie w subkomórkowej lokalizacji białka z układu pojedynczej kropki / centrosomu obserwowanego w zamkniętych nie-nowotworowych pęcherzykach (strzałki) w celu dyfuzji barwienia cytoplazmatycznego w komórkach nowotworowych. Powiększenie, × 200. Tabela Obecność zmian BRAF w brodawkowatym raku tarczycy Testowaliśmy te guzy pod kątem mutacji punktowej BRAF prowadzącej do substytucji V600E. Mutację zidentyfikowano w 38 (37%) sporadycznych guzach, w 10 (16%) guzach rozwijających się 9-12 lat po ekspozycji, ale w żadnym z nowotworów, które rozwinęły się 5. 6 lat po ekspozycji (Figura 6). Różnice w częstości występowania 2 typów aktywacji BRAF były statystycznie istotne między wczesną grupą napromieniania i zarówno późnym promieniowaniem, jak i grupami sporadycznymi (Tabela 1). Figura 6 Detekcja cDNA mutacji BRAF V600E z nowotworów po Czarnobylu, które rozwinęły się 9-12 lat po ekspozycji z zastosowaniem PCR w czasie rzeczywistym LightCycler, a następnie analizy krzywej topnienia fluorescencji. (A) Amplifikacja cDNA w czasie rzeczywistym. (B) Wykrywanie mutacji punktowych za pomocą analizy krzywej topnienia fluorescencji poamplifikacyjnej opartej na odmiennej temperaturze topnienia dupleksów utworzonych pomiędzy sondą WT a sekwencjami WT (62,8 ° C) lub zmutowanymi (57,0 ° C). Mutacje w obu próbkach są heterozygotyczne, ponieważ zarówno wykrywalne są zmutowane jak i pikty WT. Dyskusja Szlak sygnałowy MAPK jest powszechnie obecnym regulatorem wzrostu komórek, proliferacji, apoptozy i różnicowania. Ostatnio ponownie zwrócono uwagę na BRAF, istotny składnik kaskady kinaz, ponieważ mutacje w genie zidentyfikowano w kilku rodzajach raka u ludzi. Istotnie, aktywujące mutacje punktowe BRAF znaleziono w ponad 60% przypadków złośliwych czerniaków, 10. 14% raka jelita grubego i jajnika, a w bardzo niewielu przypadkach raka płuc, mięsaków tkanek miękkich i innych linii komórek rakowych (14, 26, 27). Rak tarczycy został natychmiast dodany do listy z 36-69% częstością występowania mutacji BRAF (1, 2, 13, 28). Jednakże ani BRAF, ani inne wewnątrzkomórkowe efektory wzdłuż szlaku MAPK nie były wcześniej zaangażowane w ludzką karcynogenezę poprzez mechanizmy inne niż mutacja punktowa. W niniejszym badaniu demonstrujemy aktywację BRAF poprzez przegrupowanie chromosomalne, które powoduje fuzję BRAF z genem AKAP9 w raku brodawkowatym tarczycy
[patrz też: przelicznik gram na szklanki, eve online trial, eve poradnik ]
[patrz też: eve online poradnik, eve online trial, eve online polska ]