Wariant SCID ze specyficznymi odpowiedziami immunologicznymi i przewagą Komórki T ad 7

Proliferację limfocytów T określono ilościowo, stosując standardową inkorporację [3H] tymidyny i test proliferacji CFSE. W tym celu 5 x 106 komórek PBMC znakowano barwnikiem fluorescencyjnym CFSE (Invitrogen Corp.) przez 10 minut i przemyto dwukrotnie lodowatym PBS. PBMC znakowane CFSE (2,5 x 105) w objętości 200 ul zmodyfikowanego Dulbecco. S Medium 10% FCS stymulowano albo fitohemaglutyniną (1,25. G / ml) albo z kulkami anty-CD3 / anty-CD28 ( Dynal Biotech) w 37 ° C. Kontrolne komórki hodowano w samej pożywce. W dniu 6 zebrano komórki; umyty; powierzchnia wybarwiona anty-CD3, anty-CD4 i anty-CD8 lub anty-CD3 i anty . Przeciwciała TCR; i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej na BD FACSort przy użyciu oprogramowania CellQuest Pro w wersji 4.0.2. Spektrowanie T CDR3 w komórkach. Spektroskopowanie TCR CDR3 przeprowadzono w sposób opisany uprzednio przez Pannetier, Kourilsky i in. do analizy TCR. łańcuch (38, 39). Startery do spektroskopii TCR. i TCR. nowo zaprojektowane łańcuchy: PCR (30 cykli) do analizy TCR. łańcuch przeprowadzono przy użyciu starterów do przodu TRDV1F (5a-ATGCAAAAAGTGGTCGCTATT-3a), TRDV2F (5a-ATACCGAGAAAAGGACATCTATG-3a), TRDV3F (5a-GTACCGGATAAGGCCAGATTA-3a), TRDV4F (5a-ATGACCAGCAAAATGCAACAG-3 .) TRDV5F (5a-ACCCTGCTGAAGGTCCTACAT-3a) i TRDV6F (5a -CCCTGCATTATTGATAGCCAT-3a) i primer odwrotny TRDCB (5a – GTAGAATTCCTTCACCAGACAAG-3 .), a następnie analizę spływu (3 cykle) z użyciem primery fluorescencyjne J1, J2, i Js3, opublikowane w protokole BIOMED-2 (40). PCR (30 cykli) do analizy TCR. łańcuch przeprowadzono przy użyciu starterów do przodu TRGV1F (5a-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3P), TRGV4F (5a-ATGACTCCTACACCTCCAGC-3a) i TRGV9F (5a-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3a) i startera do tyłu TRGCB (5a-CAGAAGACAAAGGTATGTTCCAG -3.), A następnie analizę spływu (3 cykle) z fluorescencyjnym oligonukleotydem TRGCRO (5a-CTTCTGGAGYTTTGTTTCAGC-3.). Wszystkie startery wybrano zgodnie z sekwencjami i starterami w bazie danych ImMunoGeneTics (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire). Startery TRDV4Fa6F i primer TRVG9F były takie same jak opublikowane w protokole BIOMED-2 (40). Analizę Heteroduplex przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi protokołami (41). Wyprowadzenie i charakterystyka Klony komórek T. TCR. + PBL pacjenta oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych (zestaw do izolacji komórek T, Miltenyi Biotec). Klony uzyskano przez ograniczające rozcieńczenie z użyciem komórek odżywczych, PHA i IL-2 i ekspandowano jak opisano wcześniej (42). Fenotyp i regiony V. TCR eksprymowane przez klony analizowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu opisanych powyżej mAb i potwierdzono za pomocą TCR. i . spekulacja. RNA ekstrahowano z klonów w celu analizy sekwencji TCR. i . więzy. Analiza reaktywności CMV. Klony komórek T. Zawiesiny CMV wytwarzane ze szczepem klinicznym TB40 / E i HFF były dostarczane przez C. Sinzger, University of Tübingen, Tübingen, Niemcy. Subkonfluentne monowarstwy komórek HFF inkubowano z zawiesiną CMV przy MOI przez godzinę i hodowano przez 5 dni w 37 ° C. Odtajałeś. Klony komórek T, które hodowano w obecności allogenicznych komórek odżywczych i 50 IU / ml IL-2 inkubowano (2 x 103 komórek / dołek) z zakażonymi CMV lub niezakażonymi HFF (2 x 105 komórek / dołek) w płaskim -długie 96-studzienkowe płytki w 37 ° C przez 6 godzin. TNF uwolniony do supernatantu oznaczono ilościowo w teście biologicznym z użyciem komórek WEHI, jak opisano wcześniej (43). Histologia i analiza molekularna klonalności. Próbki biopsji utrwalono w 4% buforowanej formalinie, zatopiono w parafinie, pocięto na 4 .m i zabarwiono immunohistochemicznie po odzyskaniu antygenu za pośrednictwem ciepła. Pierwotne przeciwciała uzyskano z DakoCytomation i obejmowały CD20 (klon L26), CD3 (klon F7.2.38), CD4 (klon MT310), CD8 (klon C8 / 144B), CD21 (klon 1F8), CD30 (klon Ber-H2) CD79a (klon JCB117), Ki 67 (klon MIB-1), onkoproteina BCL2 (klon 124), białko BCL6 (klon PG-B6p) i EBMP LMP (klon CS.1-4). Wizualizację przeciwciał uzyskano przy użyciu zestawu ChemMate Detection Kit, AP / RED (DakoCytomation). Konfigurację genu IgH w zmianach limfoproliferacyjnych oceniano za pomocą multipleksowej PCR z DNA wyizolowanego z próbki z biopsji za pomocą poprzednio opisanej metody (44). Analiza genetyczna. Analizy molekularne genów RAG przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi publikacjami (45). Podziękowania Dziękujemy C. Sinzger za dostarczenie zawiesin CMV i komórek HFF. Jesteśmy wdzięczni Peterowi Baderowi, Szpitalowi Dziecięcemu, Uniwersytetowi Frankfurckiemu w Niemczech, za dane dotyczące chimeryzmu i Olafowi Moske, Wydział Radiologii, Uniwersytet Fryburga w Niemczech, za dostarczenie tomografii komputerowej Dziękujemy Danieli Bukatz, Ingrid Janz, Sylvi Kock i Annette Schult za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte przez grant SFB620 przyznany przez niemiecką fundację badawczą: Niedobór odporności: modele kliniczne i zwierzęce (projekty A4 [S. Ehl] i Z2 [P. Fisch]). Przypisy Stosowano nietypowe skróty: CDR3, region determinujący komplementarność. 3; HFF, ludzki fibroblast napletka; OS, zespół Omenna; PHA, fitohemaglutynina; RAG1; gen aktywujący rekombinazę 1. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[przypisy: plazminogen trial, mięśnie grzbietu anatomia, plazminogen polska ]
[patrz też: nowotwór pęcherzykowy tarczycy, plazminogen, dom zdrojowy szczawno ]