Zależna od komórek T produkcja IFN-y przez komórki NK w odpowiedzi na wirus grypy A. ad 7

Tak więc siła wrodzonej odporności na infekcję wirusową może być modulowana przez ilościową i jakościową naturę odporności adaptacyjnej specyficznej dla wirusa infekującego, szczególnie w sytuacjach takich jak grypa, w której regułą jest wiele reinfekcji. W połączeniu z poprzednią pracą, nasze wyniki potwierdzają pogląd, że między składnikami odporności wrodzonej a odpornością adaptacyjną istnieją szerokie wzajemne oddziaływania, które wspólnie stanowią udaną odpowiedź immunologiczną, aby usunąć infekcję. Metody Ludzie i próbki krwi. Dwudziestu trzech dorosłych dawców (w wieku 25-65 lat) bez niedawnych objawów grypopodobnych włączono do badania za świadomą zgodą. Protokół badania został zatwierdzony przez instytutowy zespół kontrolny na Uniwersytecie Stanforda. Próbki krwi żylnej zebrano za pomocą probówek Vacutainer z heparyną sodową (Vacutainer Systems; BD). Ponadto w badaniu uwzględniono kożuszki leukocytarne uzyskane od 3 zdrowych dawców krwi w banku krwi, uzyskując w sumie 26 osobników. Przygotowanie i frakcjonowanie PBMC. PBMC przygotowano ze standardowym wirowaniem w gradiencie gradientowym z krwi pełnej lub kożuszka leukocytarnego Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech Inc.). Wyczerpanie komórek CD3 + lub wzbogacenie komórek NK i komórek T przeprowadzono stosując odpowiednie odczynniki RosetteSep (StemCell Technologies Inc.) lub MACS MicroBeads (Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotowanie wirusa grypy. Oczyszczony szczep FluA Panama / 2007/99 (H3N2) wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem (26). W skrócie, wirus hodowano w 11-dniowych jajach kurzych wolnych jaj wolnych od patogenów (Charles River Laboratories Inc.). Płyn omoczniowy zebrano 48 godzin po zakażeniu i badano na obecność wirusa, mierząc stężenie wirusa grypy HA. Płyn omoczniowy zawierający wirus zebrano i odwirowano do cząstek peletki fluA. Osad wirusa ponownie zawieszono w PBS i dalej oczyszczono przez ciągłe wirowanie w gradiencie sacharozy 15-30%. Oczyszczony wirus rekonstytuowano w PBS, stabilizowano za pomocą glutaminianu sacharozy (SPG) (BioWhittaker Inc.), dozowano do jednorazowych porcji i przechowywano w temperaturze ~ 70 ° C. Miano wirusa oznaczono za pomocą standardowych komórek nerkowych Madin-Darby psowatych (56). Cytometria przepływowa cytokin. Niefrakcjonowane lub frakcjonowane PBMC lub podzbiory limfocytów inkubowano z fluA jak opisano wcześniej (26). W skrócie, 2 x 106 komórek ponownie zawieszono w 0,1 ml pożywki RPMI-1640 bez surowicy. Oczyszczony wirus fluA dodano do komórek przy MOI wynoszącym 3 i inkubowano w 37 ° C z 5% CO2 przez godzinę. Ta sama objętość SPG została użyta jako kontrola negatywna. Pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% FCS i antybiotykami dodano do końcowej objętości 0,7 ml, z dodatkiem z następujących odczynników lub bez: szczurzego przeciwciała antyludzkiego IL-2 (3 lub jego kontroli izotypowej (BD Biosciences Pharmingen), rekombinowana ludzka IL-2 (Chiron Inc.), rekombinowana ludzka IL-12 (Sigma-Aldrich) lub rekombinowany ludzki IFN-a (prezent od L. Blatta, Intermune Inc.). Komórki inkubowano przez kolejne 11 godzin (w celu wykrycia IL-2 i IFN-a) lub 16 godzin (w celu wykrycia IFN-y). Brefelinę A (Sigma-Aldrich) dodano do końcowego stężenia 10 .g / ml w ciągu ostatnich 5 godzin inkubacji. Barwienie i analizę metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono jak opisano wcześniej (26). W skrócie, komórki najpierw wybarwiono anty-CD56 znakowanym allofikocyjaninem (BD Biosciences. Pharmingen), a następnie potraktowano roztworem do lizy FACS i roztworem permeabilizującym FACS (BD Biosciences). Permeabilizowane komórki następnie barwiono różnymi kombinacjami następujących Ab: znakowanych fikoerytryną lub znakowanych FITC przeciwciał anty IFN-y, znakowanych fikoerytryną anty-IL-2 (BD Biosciences), anty-perfoksy znakowanych FITC i PerCP- znakowane anty-CD3 (BD Biosciences. Pharmingen). Powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe wybarwianie przeprowadzano inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zabarwione komórki następnie przemyto, utrwalono 1% paraformaldehydem w PBS i analizowano przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur, z oprogramowaniem Cellquest (BD Biosciences). Analizy statystyczne. Podzbiory. średnie zostały porównane przy użyciu sparowanych testów Studenta, w niektórych przypadkach po logarytmicznej transformacji danych. Testy korelacji oparto na statystyce rangowej korelacji Spearmana rS, solidnej, niezwiązanej z dystrybucją miary korelacji (57). Progi wartości P dla pojedynczego testu dla deklarowania istotności statystycznej zostały ustalone na poziomie 0,05 lub mniej, aby wspólnie kontrolować łączny wskaźnik błędów typu I we wszystkich testach statystycznych na poziomie 0,05 (58). PodziękowaniaDziękujemy C. Zhang i L. Rott o pomoc techniczną, L. Blatt za dostarczanie zrekombinowanych IFN-y, ED Mellins i DB Lewis do przydatnych dyskusji. Prace te były wspierane przez granty NIH AI-057229 i DK-56339. Przypisy Niestandardowe skróty: fluA, wirus grypy A; IFN-a +, IFN-y wytwarzający; MFI, średnia intensywność fluorescencji; SPG, fosforan sacharozy-glutaminian. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[patrz też: eve online centrala, pierwsza pomoc oparzenia, polskie produkty spożywcze ]
[podobne: eve online centrala, dawstwo komórek jajowych, eve forum ]