Antysensowne hamowanie białka zapalnego makrofagów 1- blokuje niszczenie kości w modelu choroby szpiczaka kości

Niedawno zidentyfikowaliśmy białko zapalne makrofagów 1-. (MIP-1 a) jako czynnik produkowany przez komórki szpiczaka mnogiego (MM), które mogą być odpowiedzialne za niszczenie kości w MM (1). Aby zbadać rolę MIP-1. w chorobie kostnej MM in vivo, ludzka linia komórkowa ARH pochodząca od MM5 była trwale transfekowana konstruktem antysensownym do MIP-1. (AS-ARH) i testowano pod kątem jego zdolności do indukowania choroby kości MM u myszy SCID. Ludzki MIP-1. poziomy w osoczu krwi od myszy AS-ARH były znacząco zmniejszone w porównaniu z kontrolnymi traktowanymi komórkami ARH transfekowanymi pustym wektorem (EV-ARH). Myszy traktowane komórkami AS-ARH żyły dłużej niż kontrole i, w przeciwieństwie do kontroli, nie wykazywały żadnych radiologicznie identyfikowalnych zmian patologicznych. Analiza histomorfometryczna wykazała, że osteoklasty (OCL) na milimetr kwadratowy kości i OCL na milimetr powierzchni kości myszy AS-ARH były istotnie mniejsze niż u myszy EV-ARH, a odsetek guzów na całkowitą powierzchnię kości również był znacznie zmniejszony. Komórki AS-ARH wykazywały zmniejszoną przyleganie do komórek zrębowych szpiku, ze względu na zmniejszoną ekspresję integryny. 5. i zmniejszoną zdolność naprowadzania i przeżycie. Dane te wspierają ważną rolę MIP-1. w homingie komórkowym, przeżyciu i niszczeniu kości w MM. WstępMięśniowa choroba kości charakteryzuje się litycznymi zmianami kostnymi z niewielkim lub brakiem nowych, reaktywnych formacji kości. Do 80% pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM) cierpi na ból kości, a ponad 70% pacjentów rozwinie patologiczne złamania podczas choroby (1). Zniszczenie kości w szpiczaku jest zdarzeniem lokalnym, w którym zmiany chorobowe występują tylko w sąsiedztwie komórek szpiczaka. Dane te sugerują, że komórki MM wytwarzają czynniki lub indukują czynniki stymulujące tworzenie osteoklastów (OCL). Zastosowaliśmy metodę klonowania ekspresyjnego z biblioteką cDNA zbudowaną z RNA otrzymanego ze świeżo wyizolowanych próbek szpiku kostnego od pacjentów z MM i przeszukiwano je pod kątem czynników aktywujących osteoklasty (OAF), które indukują tworzenie OCL w hodowlach ludzkich i mysich szpiku. Zidentyfikowaliśmy białko zapalne makrofagów 1-. (MIP-1 a) jako OAF wytwarzany przez komórki szpiczaka in vivo (2). MIP-1. indukowane tworzenie OCLs wchłaniających kość w hodowlach ludzkich szpiku, działało bezpośrednio na prekursory OCL i nie ekspresjonowało ekspresji ligandu RANK (RANKL) w górę (3). Ponadto MIP-1. wzmocnił wpływ IL-6 i RANKL, cytokin obecnych w szpiku szpiczaka, na tworzenie OCL (3). Wcześniej Kukita i współpracownicy (4) zgłosili, że MIP-1. indukuje tworzenie OCL w hodowlach szpiku kostnego szczura, a Fuller i współpracownicy (5) wykazali, że MIP-1. jest chemotaktyczny dla OCL. Co ważniejsze, MIP-1. poziomy są zwiększone w osoczu szpiku od pacjentów ze szpiczakiem z aktywną chorobą, podczas gdy MIP-1. poziomy są obniżone do prawie prawidłowych poziomów u pacjentów, którzy są w pełnej remisji lub mają nieaktywną chorobę, lub którzy mają szpiczaka stopnia I (2). Co więcej, dodanie neutralizującego Ab do MIP-1. zablokował aktywność OAF obecną w próbkach osocza szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem (2). Celem obecnego badania było określenie roli MIP-1. w modelu in vivo choroby szpiczaka ludzkiego. Donieśliśmy wcześniej, że wstrzyknięcie dożylne linii komórkowej ludzkiego szpiczaka, ARH, myszom SCID napromienionym subtelnie indukuje szpiczaka u tych zwierząt (1). Te myszy rozwijają wszystkie cechy choroby szpiczaka kości, w tym lityczne uszkodzenia kości, hiperkalcemię i zwiększone tworzenie OCL w obszarach sąsiadujących z komórkami szpiczaka. Komórki ARH wytwarzają wysokie poziomy MIP-1 .. Dlatego komórki ARH były trwale transfekowane konstruktem antysensownym do MIP-1. lub pusty wektor i przeszczepione myszom SCID w celu określenia roli MIP-1. w tym zwierzęcym modelu choroby kości szpiczaka ludzkiego. Metody Konstruowanie linii komórkowych ARH trwale transfekowanych konstruktem antysensownym do ludzkiego MIP-1. lub pusty wektor. MIP-1. klon antysensowny skonstruowano w wektorze pcDNA3. Pierwszy ekton człowieka MIP-1. cDNA (159 bp) (6) wytworzono standardowymi technikami PCR z użyciem specyficznych starterów MIP-1. 5a, 5. – CAG AAG GAC ACG GGC AGC AG-3. (sens) i 5 (3-GTG ATG CAG AGA ACT GGT TG-3. (antysensowny) (6). Produkt PCR wklonowano do wektora klonującego TA (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA), a następnie przeprowadzono analizę sekwencji DNA. Pierwszy ekton MIP-1. cDNA następnie strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI i wstawiono do odwrotnej orientacji do wektora, który linearyzowano enzymem restrykcyjnym EcoRI (Figura 1). Orientacja MIP-1. konstrukt określono stosując techniki PCR z T7 i MIP-1. sensowne i antysensowne startery, a następnie sekwencjonowanie DNA
[patrz też: sushi a karmienie piersią, inteligencja interpersonalna, nowotwór pęcherzykowy tarczycy ]
[więcej w: inteligencja interpersonalna, polskie produkty spożywcze, eve online poradnik ]