Komórkowa odpowiedź immunologiczna związana z chorobą u cukrzyków typu 1 z immunodominującym epitopem insuliny cd

Wzajemne wyniki dla rodzeństwa kontrolnego obejmowały C11 z P1, C12, C13, z P2 i H5 z P12, podczas gdy kontrolne dopasowania hl-genu pacjenta HLA to C5 z P9, C11 z P2 i H5 z zarówno P11, jak i P12. Wszyscy pacjenci z cukrzycą o niedawnym początku poddawali się insulinie ludzkiej po rozpoznaniu, która wynosiła od 2 do 127 dni (średnio = 64 dni) przed pobraniem krwi. Aby kontrolować pod kątem możliwości, że odpowiedź immunologiczna typu B (9. 23) rozwinęła się w wyniku leczenia insuliną, odpowiedź na B (9. 23) została zbadana u dwóch pacjentów (C27 i C28) z cukrzycą typu 2 (tj. choroba nie-autoimmunologiczna), którzy otrzymywali terapię insulinową z powodu tłumionej produkcji insuliny. Ponadto badano pięć wysokiego ryzyka krewnych pierwszego stopnia chorych na cukrzycę typu 1, którzy nie otrzymywali terapii insulinowej, w zakresie odpowiedzi na B (9-23). Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisje Badania Badania z University of California, San Diego oraz Children s Hospital and Health Centre. Peptydy, odczynniki i podłoże do hodowli tkankowej. Następujące peptydy zsyntetyzowano metodą z fazą stałą jak opisano w innym miejscu (24): ludzki insulinowy łańcuch B (9. 23) amid (B (9. 23)) [SHLVEALYLVCGERG], wieloliniowy mioglobina 10-121 (SWM) i biotynylowany peptyd wirusa wirusa opryszczki pospolitej-2 (HSV-2) VP16 430-444 (EEVDMTPADALDDFD). Pożywką stosowaną we wszystkich hodowlach komórkowych i testach była DMEM zawierająca wysoką glukozę (Cellgro, Herndon, Virginia, USA) uzupełnioną 2 mM L-glutaminą, 10 mM HEPES (Cellgro), nieistotnymi aminokwasami (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri USA), mM pirogronianu sodu, 50 ug / ml gentamycyny, 126 ug / ml L-argininy, 20 ug / ml kwasu L-asparaginowego (Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA), 50 . M 2-merkaptoetanol (Sigma Chemical Co.), 5 | ag / ml penicyliny i 100 U / ml streptomycyny (Life Technologies Inc.) i 5% autologicznej ludzkiej surowicy lub osocza. Bez azydkowe preparaty mysich mAb anty-ludzkich HLA-DQ (SPV-L3) i HLA-DR (LN3) (Neomarkers Inc., Fremont, Kalifornia, USA) i mAb kontrolnych dopasowanych do izotypu zastosowano w optymalne stężenie (20 .g / ml). Wytwarzanie krótkookresowych linii limfocytów T specyficznych dla insuliny B (9. 23) z krwi obwodowej. PBMC od wszystkich osobników izolowano przez wirowanie przez gradienty gęstości Ficoll-Hypaque (Vacutainer CPT, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, New Jersey, USA), a limfocyty przemywano i albo stymulowano peptydem B (9. 23) w celu wytworzenia T- linie komórkowe lub przechowywane zamrożone w porcjach dla przyszłej oceny wytwarzania cytokin przy użyciu testu ELISPOT. Linie komórkowe T specyficzne dla insuliny B (9-223) wytworzono przez hodowlę 5 x 106 oczyszczonych PBMC na studzienkę 24-studzienkowej płytki hodowlanej (Falcon, Becton Dickinson Labware) w obecności 10. M insuliny B (9. 23) przez 7. 10 dni. Po przemyciu, 3 x 106 komórek T ponownie stymulowano w 25 cm2 kolbach do hodowli tkankowej za pomocą 6 x 105 napromienionych (30 Gy) autologicznych PBMC jako komórek prezentujących antygen (stosunek 1: 5 komórek prezentujących antygen / komórek T) w obecności B (9. 23) peptyd (10. M) i rekombinowana ludzka IL-2 (5 U / ml, Boehringer Mannheim, Niemcy) przez kolejne 7. 10 dni. Po dodatkowym cyklu stymulacji w testach proliferacji zastosowano limfocyty. Autologiczne PBMC stosowane do ponownej stymulacji linii komórek T były przechowywane zamrożone do momentu użycia. Test proliferacji limfocytów T. Łącznie 105 limfocytów T z linii komórkowych hodowano w 96-dołkowych okrągłodennych płytkach (Costar, Corning Inc., Corning, New York, USA) z 7 x 104 napromienionymi autologicznymi PBMC (optymalna liczba komórek) w obecności lub nieobecności różnych stężeń peptydu insuliny B (9. 23) lub fitohemaglutyniny (PHA-M, L8902, Sigma Chemical Co.). Komórki hodowano w temperaturze 37 ° C, 7,5% CO2 w nawilżanym inkubatorze przez 5 dni, a każdy dołek pulsowano trytem tymocyny o stężeniu CiC ([3H] TdR; sp. Aktu 25 Ci / mmol; Amersham Life Science, Arlington Heights, Illinois, USA) na ostatnie 18. 20 godzin. Komórki zebrano na płytkach wyłożonych włóknem szklanym (Unifilter-96 GF / B, Packard Instrument Co., Meriden, Connecticut, USA) i ilość radioaktywności wprowadzonej do zsyntetyzowanego DNA de novo mierzono w liczniku scyntylacyjnym (Top Count NXT; Packard Instrument Co.). Test ELISPOT. Liczbę komórek wykazujących ekspresję cytokin w PBMC od osób kontrolnych i pacjentów z cukrzycą typu oszacowano ilościowo w teście ELISPOT, jak opisano w innym miejscu (25). W skrócie, 3 x 105 PBMC otrzymanych z zamrożonych porcji zaszczepiono na studzienkę 96-studzienkowych płytek powleczonych antyludzkim IFN-y. mAb (Endogen Inc., Cambridge, Massachusetts, USA) lub inne przeciwciało anty-cytokiny (PharMingen Inc., San Diego, Kalifornia, USA) w obecności lub nieobecności peptydu B (9. 23), toksoidu tężcowego (dokładna chemia & Scientific Corp., Westbury, New York, USA) lub PHA (Sigma Chemical Co.)
[podobne: ostrzykiwanie osoczem cena, rezonans magnetyczny kościerzyna, mięśnie grzbietu anatomia ]
[podobne: szpital psychiatryczny lublin, pierwsza pomoc oparzenia, rezonans magnetyczny kościerzyna ]