Nadekspresja Cyclin D1 i inaktywacja p53 unieśmiertelniają pierwotne keratynocyty doustne za pomocą mechanizmu niezależnego od telomerazy ad

Cyklina D1 wiąże się z cdk 4 i 6, a kompleks fosforyluje i dezaktywuje pRb; inaktywujących mutacji pRb nie obserwuje się w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej i przełyku. Natomiast mutacje p53 często występują w raku jamy ustnej i przełyku. Ponadto, p53 jest inaktywowany w dużej części ustnych zmian dysplastycznych, co implikuje rolę w inicjacji unieśmiertelniania w tym typie komórek (22). Podążając za tymi wzorcami zdarzeń genetycznych obserwowanych podczas rozwoju nowotworu in vivo, staraliśmy się zidentyfikować rolę nadekspresji cykliny D1 i funkcjonalną inaktywację p53 w unieśmiertelnieniu ludzkich komórek nabłonka łuskowatego lub keratynocytów. Cyklina D1 sama lub w połączeniu z dominującą negatywną p53 była ektopowo poddawana nadmiernej ekspresji w prawidłowych ludzkich doustnych keratynocytach w hodowli z zastosowaniem transdukcji retrowirusowej. Podczas gdy nadekspresja cykliny D1 wydłużyła okres replikacji pierwotnych ludzkich doustnych keratynocytów, połączenie z dominującym negatywnym p53 spowodowało unieśmiertelnienie tych komórek. Co ważne, unieśmiertelnienie w tych warunkach było niezależne od aktywności telomerazy. Metody Hodowla komórkowa i infekcja retrowirusowa. Normalne diploidalne ludzkie doustne keratynocyty (OKF6) ustalono na podstawie biopsji normalnej podłogi jamy klinicznie i genetycznie prawidłowej tkanki. Komórki OKF6 zostały poddane kriokonserwacji w pierwszych dwóch seryjnych pasażach w hodowli i charakteryzowały się ekstensywnie (23). OKF6 i linie wytworzone z nich (OKF6-LacZ, OKF6-D1, OKF6-P53, OKF6-D1 / P53) hodowano w zdefiniowanym SFM keratynocytów z określonym suplementem wzrostu (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA) i końcowe stężenie Ca2 + 0,4 mM. Pożywkę uzupełniono antybiotykami. Aby ocenić zależność od mitogenu, komórki wysiewano w zdefiniowanym SFM keratynocytów uzupełnionym obniżonym stężeniem (10%) czynników wzrostu. Amfotropową linię komórek pakujących Phoenix A hodowano w suplementowanej DMEM (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), a następnie przejściowo transfekowano odpowiednim wektorem retrowirusowym w celu wytworzenia amfotropowych retrowirusów. Supernatant retrowirusowy zebrano 48 godzin po transfekcji i przesączono przez filtr 0,45 .m i zastosowano świeży supernatant retrowirusowy do infekowania eksponencjalnie rosnących komórek OKF6. Pożywkę zawierającą puromycynę (1 .g / ml) i / lub G418 (400 mg / ml) wymieniono w celu rozpoczęcia selekcji 48 godzin po zakażeniu. W każdym zestawie eksperymentów zebrano wiele klonów do dalszego przetwarzania po 1-2 dniach doboru puromycyny i / lub 5 dni selekcji G418. Retrowirusowe wektory ekspresyjne pBPSTR-D1 i pBABE-LacZ otrzymano od SA Reeves (Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA) (24). Indukowalny wektor retrowirusowy pBPSTR-D1 zawiera oba elementy układu regulowanego tetracykliną i został opisany wcześniej przez nas i innych (25). Gen będący przedmiotem zainteresowania wyraża się w nieobecności tetracykliny (system wektorowy TET-OFF). Gen oporności na puromycynę pod kontrolą promotora w obrębie 5 (3-LTR jest obecny w obu wektorach retrowirusowych. Wektor LXSN zawierający sekwencję kodującą p53 z mutacją V143A zastosowano do wytworzenia dominującej negatywnej wersji p53 (26). Określenie replikacyjnej żywotności. Szeregowe hodowle różnych linii OKF6 (OKF6, OKF6-LacZ, OKF6-D1, OKF6-P53, OKF6-D1 / P53) przeprowadzono na 10-cm szalkach przez wysianie 105 komórek, ponowne pobieranie komórek co drugi dzień, i subkulturowanie co 4-5 dni. Podwojenie liczby każdego pasażowania obliczono, stosując wzór PD = (nf / n0) / log2, gdzie n0 jest początkową liczbą komórek, a nf jest ostatnią liczbą komórek. Unieruchomienie komórkowe zdefiniowano jako wzrost komórek co najmniej trzykrotnie przekraczający długość życia komórek rodzicielskich. Cytometrii przepływowej. Wykładniczo rosnące komórki zebrano przy różnych czasach podwojenia populacji (PD) i odwirowano przy 300 g przez 4 minuty. Osad komórkowy ponownie zawieszono w 0,5 ml PBS, utrwalono w 5 ml 70% etanolu i przechowywano w temperaturze ~ 20 ° C przez noc. Komórki następnie przemyto dwukrotnie PBS i ponownie zawieszono w ml roztworze zawierającym 3,8 mM cytrynian sodu i 10 .g / ml jodku propidyny. Po 10 mg / ml traktowania RNazą w 37 ° C przez 20 minut, próbki analizowano przez sorter komórek aktywowany fluorescencyjnie (FACScan, Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA). Analiza Western blot. Lizaty z wykładniczo rosnących komórek zebrano w buforze (50 mM HEPES [pH 7,4], 0,1% Nonidet P-40 i 250 mM NaCl) z mM proteazy i 10 mM inhibitorami fosfatazy. Łącznie 10 .g całkowitego białka rozdzielono na 10% żelach SDS-poliakryloamidowych i przeniesiono na membrany Immobilon (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA)
[patrz też: mięśnie grzbietu anatomia, sushi a karmienie piersią, szpital psychiatryczny lublin ]
[patrz też: eve online poradnik, eve online trial, eve online polska ]