Nadekspresja Cyclin D1 i inaktywacja p53 unieśmiertelniają pierwotne keratynocyty doustne za pomocą mechanizmu niezależnego od telomerazy cd

Blokowanie przeprowadzono w 5% mleku, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl i 0,2% Tween-20 przez godzinę, a następnie inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami, jak wskazano (1: 3 000). Drugim przeciwciałem była skoniugowana z peroksydazą przeciwciało przeciwko mysiej lub anty-króliczej Ig (1: 2,500; Amersham Corp., Burlington, Massachusetts, USA). Wykrywanie odbywało się za pomocą chemiluminescencji (ECL, Amersham Corp.). Zastosowano pierwotne przeciwciała: monoklonalne przeciwciało cyklin D1 (HD11), poliklonalne przeciwciało cyklin D1 (H295), monoklonalne przeciwciało p53 421, monoklonalne przeciwciało p53 122 i monoklonalne przeciwciało p16 (JC8). Kwantyfikację przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Image (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). Testy TRAP / testy długości telomerowej. Komórkowe ekstrakty z wszystkich wytworzonych doustnych keratynocytów badano pod względem aktywności telomerazy, stosując test PCR oparty na powtórnej amplifikacji telomerazy (TRAP) (27). Wyciągi komórkowe (50 i 500 ng) wraz z kontrolnymi inaktywowanymi ciepłem stosowano do oznaczeń TRAP. Długość telomerów mierzono przez hybrydyzację znakowanej 32P sondy telomerowej (CCCTAA) z 10 .g genomowego DNA trawionego Hinfl i RsaI jak opisano wcześniej (27). Analiza karyotypiczna. Wykładniczo rosnące hodowane komórki OKF6 i OKF6-D1 / p53 inkubowano z 10. 7 M Colcemid (Life Technologies Inc.) przez godzinę, ponownie zawieszono w ciepłym buforze hipotonicznym (0,075 M KCl), pozostawiono do spęcznienia przez 10. 15 minut w temperaturze pokojowej. 37 ° C, utrwalono przez dodanie zimnego etanolu / kwasu octowego i nałożono na schłodzone szkiełka mikroskopowe. Preparaty chromosomów hodowanych komórek zostały policzone dla liczby metafazowych środków do smarowania. Spready Metaphase (> 10) były następnie analizowane przy różnych czasach PD w University of Pennsylvania Cytogenetics Core Facility. Podskórne testy rakotwórczości. 6-8-tygodniowym bezgrasiczym, pozbawionym odporności myszom nagim (NIH III, Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) wstrzyknięto zawiesinę komórek zawierającą 2 x 106 wykładniczo rosnących hodowanych OKF6, OKF6-D1 / P53, SCC15 ( linia komórek raka płaskokomórkowego) lub TE 12 (linia komórek raka płaskonabłonkowego przełyku). Wielkość guza mierzono co 3 dni. Czas początkowego tworzenia się guza określono jako czas, w którym guz osiągnął średnicę 3 mm. Myszy uśmiercono, gdy guzy urosły do średnicy cm lub po 12 tygodniach monitorowania, a następnie zostały zanalizowane. Wyniki Ektopowa nadekspresja cykliny D1 w prawidłowych ludzkich doustnych keratynocytach indukuje nieprawidłowości w cyklu komórkowym i wydłużenie okresu replikacji. Aby wyjaśnić rolę onkogenu cykliny D1 w unieśmiertelnieniu komórek nabłonka w nabłonku jamy ustnej, ektopowo poddaje się nadekspresji cyklinę D1 w prawidłowych ludzkich keratynocytach jamy ustnej. Aby nadeksprymować cyklinę D1, użyliśmy systemu wektora retrowirusowego regulowanego tetracykliną, pBPSTR-D1, zawierającego cDNA ludzkiej cykliny D1, do zakażenia prawidłowych ludzkich doustnych keratynocytów (OKF6). Komórki OKF6 zostały opisane wcześniej i nie wykazują żadnych zmian genetycznych (14, 23). Do infekcji użyto układu indukowalnego tetracykliną, aby zapobiec potencjalnym toksycznym efektom nadekspresji cykliny D1. Biorąc pod uwagę, że nie obserwowano żadnej toksyczności, cykliny D1 ulegały konstytucyjnej ekspresji (TET off) w następujących eksperymentach (25). Skuteczność infekcji monitorowano i potwierdzano za pomocą genu lacZ zawierającego retrowirus (pBabe-lacZ). Zainfekowane komórki OKF6 wybrano odpowiednim antybiotykiem, a wybrane klony połączono w pulę, aby zapewnić poliklonalność. Komórki użyte do dalszych badań nazwano OKF6-D1. Poziomy endogennej i ektopowo eksprymowanej cykliny D1 w macierzystych komórkach zakażonych OKF6 i cyklinie Dl (komórki OKF6-D1) określano za pomocą analizy Western blot (Figura 1a). Figura Wpływ nadekspresji cykliny D1 i / lub dominującej negatywnej ekspresji p53 w doustnych keratynocytach (OKF6). (a) Równe ilości białka dla rodzicielskiego OKF6, OKF6-pp53, OKF6-D1 i OKF6-D1 / p53 rozdzielono na 10% SDS-PAGE. Poziom nadekspresji cykliny D1 był porównywany przez kolejną analizę immunoblot przy użyciu poliklonalnego przeciwciała cyklin D1 (H295) i przeciwciała monoklonalnego cykliny D1 (HD11) (danych nie przedstawiono). (b) Równe ilości białka dla rodzicielskiego OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 wyodrębniono na 10% SDS-PAGE. Kolejny immunoblot przeprowadzono z dwoma różnymi konformacyjnymi przeciwciałami p53: monoklonalnym przeciwciałem p53 421 i monoklonalnym przeciwciałem p53 122. Ludzkie komórki nowotworowe A431 służyły jako kontrola pozytywna. Ponieważ cyklina D1 odgrywa ważną rolę w progresji cyklu komórkowego w cyklu G1, badaliśmy wpływ nadekspresji cykliny D1 na dynamikę cyklu komórkowego w tych komórkach.
[podobne: szpital psychiatryczny lublin, gatunek tłustego śledzia, polskie produkty spożywcze ]
[hasła pokrewne: eve poradnik, eve online pl, łyżeczka cukru ile to gram ]