Nadekspresja Cyclin D1 i inaktywacja p53 unieśmiertelniają pierwotne keratynocyty doustne za pomocą mechanizmu niezależnego od telomerazy czesc 4

Analiza metodą cytometrii przepływowej ujawniła wyraźną redystrybucję cyklu komórkowego w komórkach OKF6-D1, z 20% wzrostem cykli komórkowych w fazie S w porównaniu z rodzicielskimi komórkami OKF6 (Figura 2, aib). Podobne wyniki zaobserwowano w pięciu oddzielnych eksperymentach transdukcji cykliny D1 (dane nie przedstawione). Figura 2 Model cyklu komórkowego rodzicielskich i pochodnych doustnych keratynocytów. Analiza cyklu komórkowego komórek OKF6, OKF6-D1, OKF6-p53 i OKF6-D1 / p53 przeprowadzono w standardowych warunkach z użyciem FACScan. Analiza cyklu komórkowego jest wyświetlana jako histogram lub jako tabela. (a) OKF6; (b) OKF6-D1; (c) OKF6-p53; i (d) OKF6-D1 / p53. Następnie badaliśmy wzrost tych komórek przy przedłużonym pasażowaniu w hodowli. Zarówno komórki OKF6, jak i komórki OKF6 transdukowane wektorem kontrolnym (OKF6-LacZ) miały 40 PD, o czym świadczy zatrzymanie wzrostu i powiększenie komórek w hodowli (Figura 3). Dla kontrastu, żywotność replikatywna komórek OKF6-D1 została istotnie zwiększona w sposób powtarzalny do 80 PD, w którym to czasie ostatecznie zaostrzono komórki OKF6-D1 (Figura 3). Należy zauważyć, że produkt białkowy supresora guza p16 był obniżony we wczesnych pasażach, ale ekspresja była wysoka we wstępnych pasażach komórek OKF6-D1 (dane nie pokazane). Figura 3 Okres życia właściwego rodzicielskich i pochodnych doustnych keratynocytów. (a) Charakterystyka wzrostu rodzicielskich i uzyskanych komórek OKF6 jest przedstawiona następująco: OKF6 (kółka), OKF6-D1 (trójkąty), OKF6- (3 p53 (kwadraty) i OKF6-D1 / p53 (diamenty). (b) Replikacyjną długość życia OKF6, OKF6-lacZ, OKF6-D1, OKF6-p p53 i OKF6-D1 / p53 oceniano przez obliczenie PD każdej linii komórkowej. Immortalizację oceniano, jeśli komórki wzrosły co najmniej trzykrotnie dłużej niż długość życia komórek rodzicielskich. Ekspresja ektopowa dominująco-ujemnego p53 w komórkach OKF6-D1 powoduje unieśmiertelnienie. Biorąc pod uwagę, że inaktywacja p53 wydaje się być ważna we wczesnych fazach rakotwórczości jamy ustnej i przełyku, zbadaliśmy funkcjonalne konsekwencje inaktywacji p53 w połączeniu z nadekspresją cykliny D1 w ludzkich doustnych keratynocytach. Przeprowadzono niezależne doświadczenia transdukcji w celu ekspresji dominującej negatywnej wersji genu supresorowego guza p53 (V143A) w komórkach OKF6-D1. Klony z każdego eksperymentu połączono i ustalono jako keratynocyty doustne OKF6-D1 / P53. Aby wykluczyć możliwość, że zmiany nastąpiły w wyniku specyficznej selekcji genetycznej w jednym generowanym szczepie komórkowym, ustalono drugi szczep z innego doświadczenia transdukcji. Oba szczepy ujawniły identyczne cechy genetyczne i właściwości wzrostu. Wpływ dominującego negatywnego mutanta p53 wykazano przez stabilizację białka p53 w zakażonych komórkach, co oceniono za pomocą analizy Western blot przy użyciu dwóch różnych konformacyjnych przeciwciał p53 (Figura 1b). Oba szczepy komórek OKF6-D1 / p53 ujawniły stabilizowane białko p53, podobnie jak komórki OKF6-p p53 w porównaniu z komórkami OKF6-D1 lub rodzicielskimi doustnymi keratynocytami, gdzie nie wykryto sygnału p53 (Figura 1b). Analiza FACS komórek OKF6-D1 / p53 ujawniła redystrybucję w cyklu komórkowym porównywalną do tej w komórkach OKF6-D1, podczas gdy komórki OKF6-p p53 nie wykazywały znaczącej redystrybucji w cyklu komórkowym (Figura 2, c i d). Analizę FACS wykonano przy różnych czasach PD (wczesna PD i późna PD), ale nie zaobserwowano większych różnic (dane nie przedstawione). Szczepy komórek OKF6-D1 / P53 ujawniły wydłużenie okresu replikacji do ponad 160 PD i kontynuowały wzrost w hodowli (Figura 3). Tak więc nadekspresja zarówno cykliny D1, jak i dominująco-negatywnego p53 odtwarza w sposób odtwarzalny ludzkie doustne keratynocyty. Można sobie wyobrazić, że nieokreślone przejście w hodowli doprowadzi ostatecznie do nabycia innych zmian genetycznych i szczerej transformacji. Nie wykryliśmy początku powszechnej śmierci komórek podczas pasażowania szczepów komórek OKF6-D1 / P53 obserwowanych podczas kryzysu w unieśmiertelnionych komórkach SV40. Apoptozy nie obserwowano na podstawie oceny mikroskopowej świetlnej lub przez drabinkę DNA (Figura 3 i dane nie pokazane) pomimo małego piku sub-G1 w analizie FACS. Zatem pik sub-G1 obserwowany w komórkach OKF6-D1 / p53 nie wydaje się być zgodny z apoptozą. Komórki OKF6- (3 p53 wykazywały wydłużenie okresu replikacji (100 PD), który był nieco bardziej wyraźny niż w komórkach OKF6-D1, ale ostatecznie został zahamowany (Figura 3). Co ciekawe, zaobserwowano jedynie minimalny wzrost populacji komórek poliploidalnych w komórkach OKF6-p53 podczas pasażowania seryjnego (dane nie przedstawione). Chociaż p16 było obniżone we wczesnych pasażach komórek OKF6-D1, a następnie ulegało ekspresji w starzejących się komórkach, było ono w sposób ciągły eksprymowane w komórkach OKF6-D1 / P53 (dane nie przedstawione). Mechanizm unieśmiertelniania w komórkach OKF6-D1 / p53
[przypisy: mięśnie grzbietu anatomia, szpital psychiatryczny lublin, łyżeczka cukru ile to gram ]
[patrz też: sanatorium krynica górska, szpital psychiatryczny lublin, pierwsza pomoc oparzenia ]