Regulacja rozprzestrzeniania się napadów przez neuroserpinę i tkankowy aktywator plazminogenu jest niezależna od plazminogenu ad

Ponadto działanie tPA w rozprzestrzenianiu się nieprawidłowej aktywności elektrycznej indukowanej przez KA jest niezależnym od plazminogenu zdarzeniem, które może zostać zablokowane przez podanie neuroserpiny. Metody Przygotowanie i chirurgia zwierzęca. Użyliśmy dorosłych szczurów Sprague-Dawley ważących 350-400 g, i C57BL / 6J-Plg p / p, C57BL / 6J-tPA p / P i C57BL / 6J pAI-1 P / p. myszy lub ich rodzeństwo dzikie i heterozygotyczne rodzą według opisu genetycznego (20). Trzy mikrolitry 1,0 nM KA (AG Scientific, San Diego, Kalifornia, USA) w PBS wstrzyknięto jednostronnie do ciała migdałowatego znieczulonych zwierząt za pomocą strzykawki Hamilton 26 gauge (Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA). Współrzędne wstrzyknięcia KA szczurom były następujące: bregma, ~ 3,60 mm; przyśrodkowo-boczny, 5 mm; i grzbietowo-brzuszna, 9 mm. Dla myszy były to: bregma,. 1,58 mm; przyśrodkowo-boczny, 3,3 mm; i grzbietowo-brzuszna, 4,5 mm. PBS lub 16. M rekombinowanej neuroserpin w PBS, oczyszczonej jak opisano (11) i zawierającej mniej niż jednostkę endotoksyny / mg, przefiltrowano sterylnie i wstrzyknięto na te współrzędne: bregma, ~ 3,60 mm; przyśrodkowo-boczny, 2,5 mm; i grzbietowo-brzuszne 3,5 mm (szczury); i bregma, 0,70 mm; przyśrodkowo-boczny, 1,5 mm; i grzbietowo-brzuszne, 2 mm (myszy) (21, 22). Operacyjne nacięcie przez ciało modzelowe przeprowadzono jak opisano (23), i po godzinie szczury poddano eutanazji i ekstrakty mózgowe przygotowano do zymografii SDS-PAGE. Aktywność proteazy in situ, wykrywanie neuroserpiny i zymografia. Szczury poddano perfuzji 10, 30 i 60 minut po wstrzyknięciu KA. Następnie mózgi usunięto, natychmiast zamrożono w OCT i przechowywano w temperaturze około 70 ° C. Skrawki kriostatu (5 .m) wybarwiono 100. M 4., 6-diamidino-2-fenyloindolo-2HCl (DAPI) przez 30 sekund, przepłukano w PBS, a następnie analizowano pod kątem aktywności proteazy in situ jak opisano (24), z modyfikacjami dla tPA (13). W skrócie, 100.l nakładek 1% agarozy w PBS zawierającej | ag / ml kazeiny BODIPY TR-X (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), 5 mM EDTA z plazminogenem lub bez niego (Molecular Innovations Inc., Southfield, Michigan, USA), z przeciwciałami anty-tPA lub bez nich, nałożono na wstępnie ogoloną tkankę i zamknięto pod szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Preparaty inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C, a następnie analizowano fluorescencję kazeiny, jak opisano (24). W celu wykrycia antygenu neuroserpin analizowano sąsiednie skrawki, a szkiełka przemywano dwukrotnie PBS między etapami. Skrawki utrwalono w 0,3% nadtlenku wodoru w metanolu przez 30 minut, barwiono przez 30 sekund DAPI, blokowano przez 30 minut w 0,1% BSA / 10% surowicy koziej i inkubowano z króliczą anty-neuroserpiną (1: 1000) przez 30 minut , a następnie kozie anty-królika Alexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc.) (1: 500) przez 30 minut. Dla zymografii SDS-PAGE, region mózgu zawierający hipokamp grzbietowy ze zwierząt traktowanych neuroserpiną i PBS wycięto z obu półkul godzinę po wstrzyknięciu KA, zamrożono w suchym lodzie i przechowywano w temperaturze <70 ° C. Ekstrakcję białka i zymografię agarozową zależną od plazminogenu przeprowadzono zgodnie z opisem (13). Liczba komórek hipokampa. W celu oceny ilościowej indukowanej napadami utraty komórek u szczurów po wstrzyknięciu albo PBS albo neuroserpiny, szczury perfundowano przez nakłucie wewnątrzsercowe PBS, a następnie 10% zbuforowaną formaliną, a mózgi utrwalano przez 24 godziny w 70% etanolu. Sekwencje seryjne (5 .m) przez grzbietowy hipokamp przygotowano i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E). Każdą sekcję obserwowano mikroskopowo i poddawano analizie ilościowej przez klasyfikowanie komórek jako żywych lub martwych na podstawie ich wyglądu w H & E. Średnia każdej kategorii z różnych rejonów hipokampalnych była porównywana z podobnymi pomiarami uzyskanymi u szczurów leczonych pozornie. Klasyfikacja napadów padaczkowych i rejestracja potencjału miejscowego hipokampa. Zwierzęta obserwowano przez 120 minut, a kliniczne napady padaczkowe klasyfikowano w następujący sposób: 1, szarpnięcia miokloniczne obejmujące głowę i szyję; 2, jednostronna aktywność toniczno-kloniczna w kończynach; 3, uogólnione obustronne działanie toniczno-kloniczne. Elektroencefalogram (EEG) rejestrowano przez 15 minut przed wstrzyknięciem KA i PBS lub neuroserpiny i przez 2 godziny później za pomocą lokalnych elektrod potencjału pola umieszczonych w regionie CA1 hipokampa. Elektrodę odniesienia umieszczono w móżdżku. W tym monopolarnym układzie zapisu sygnał EEG przede wszystkim rejestruje aktywność neuronalną w tkance hipokampa (hipokampa). Analiza statystyczna. Wszystkie dane są przedstawione jako średnie. SE i zostały przeanalizowane pod kątem istotności przy użyciu testu ucznia. Wartości P mniejsze niż 0,05 uważano za istotne statystycznie i oznaczono na nich gwiazdką. Wyniki Model zwierzęcy drgawek [patrz też: ostrzykiwanie osoczem cena, szpital psychiatryczny lublin, dom zdrojowy szczawno zdrój ] [więcej w: eve poradnik, eve online pl, łyżeczka cukru ile to gram ]